將CAG-LSL-2xKRAB-dCas9-IRES-EGFP-WPRE-pA插入到小鼠Rosa26基因中，建立CRISPRi基因表達(dá)調(diào)控工具小鼠。該小鼠已去掉stop。 CRISPRi是基于一個沒有核酸酶活性的dCas9蛋白，當(dāng)dCas9被引導(dǎo)到某個基因的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)TSS（transcription start site）時，dCas9能夠物理性阻礙RNA聚合酶的通過，導(dǎo)致基因沉默。為了進(jìn)一步提高轉(zhuǎn)錄抑制的效率，dCas9可以融合一些基因抑制結(jié)構(gòu)域，如KRAB（krüppel-associated box）結(jié)構(gòu)域，強(qiáng)化抑制效果。

通過Westernblot驗(yàn)證2xKRAB-dCas9表達(dá)

Rosa26- CAG-LSL-2xKRAB-dCas9?mice were crossed with Dppa3-Cre mice to delete STOP cassette.

圖1 該小鼠含有l(wèi)oxp-STOP-loxp結(jié)構(gòu)，是條件性過表達(dá)2XKRAB-dCas9，需要和Cre交配才能表達(dá)2XKRAB-dCas9 。該小鼠和廣泛表達(dá)的Cre(Dppa3-Cre)交配后檢測Cas9表達(dá)，westernblot檢測發(fā)現(xiàn)Cas9在肝臟、脾、肺、腎、胸腺、皮質(zhì)和小腦中都高表達(dá)。

通過熒光測定驗(yàn)證EGFP表達(dá)

圖2 該小鼠和廣泛表達(dá)的Cre（Dppa3-Cre）交配后檢測EGFP表達(dá)，檢測發(fā)現(xiàn)大腦、肺、腎、胸腺、肝臟中EGFP表達(dá)較強(qiáng)。