2024年9月25日，上?？萍即髮W張輝、同濟大學唐娟、復旦大學劉琛共同通訊在Circulation（IF=35.5）雜志上在線發(fā)表了題為“Activation of Imprinted Gene PW1 Promotes Cardiac Fibrosis After Ischemic Injury”的研究論文。該研究表明印跡基因PW1的激活促進缺血性損傷后心臟纖維化。

印記基因是一類特殊的基因，它們僅表達來自父母一方的等位基因，而另一方的等位基因則不表達。這種表達模式的調(diào)控機制主要包括DNA甲基化、組蛋白修飾以及長鏈非編碼RNA的作用等。近年來的研究表明，印記基因在多種生物學過程中發(fā)揮著重要作用，尤其是在胚胎心臟發(fā)育和先天性心臟病的發(fā)生中扮演著關(guān)鍵角色。盡管如此，關(guān)于印記基因是否參與成年心臟損傷后的再生和修復過程，目前的研究還相對較少。

心臟纖維化以心肌細胞外基質(zhì)（ECM）沉積過多為特征，是心臟病治療的重要目標。PW1（父系表達基因3）是一個由父系等位基因表達的印跡基因，從頭嘌呤生物合成（DNPB）是核苷酸合成的重要途徑。然而，PW1和DNPB在心肌缺血時心肌成纖維細胞產(chǎn)生ECM中的作用尚不清楚。

為評估Pw1的父本和母本等位基因的表達情況，作者構(gòu)建了Pw1^{CreER-2A-eGFP}（Pw1^CreER）小鼠。并通過將雄性雜合子Pw1^CreER/+小鼠與雌性Rosa26-loxp-stop-loxp-tdTomato（R26-tdTomato）報告小鼠交配獲得Pw1^pCreER/m+;R26-tdTomato小鼠。雌性雜合子Pw1^CreER/+小鼠與雄性R26-tdTomato報告小鼠雜交獲得Pw1^p+/mCreER;R26-tdTomato小鼠。結(jié)果表明，在Pw1^pCreER/m+; R26-tdTomato小鼠的腸道、骨骼肌、胃、肺和心臟中觀察到強的tdTomato信號，并且發(fā)現(xiàn)在心房中tdTomato表達水平高，而心室中表達水平較低。相比之下，在Pw1^p+/mCreER;R26-tdTomato小鼠的器官中未檢測到tdTomato信號。以上結(jié)果提示，Pw1只有父本等位基因在正常成年小鼠心臟中是活躍的。

Fig1. Pw1父本等位基因在正常成年小鼠心臟中活躍。

接下來，作者探究了在通過結(jié)扎左前降支（LAD）冠狀動脈誘導的心肌梗死（myocardial?

Infarction，MI）心臟中Pw1等位基因的表達。結(jié)果表明，與假手術(shù)心臟的心室相比，梗死區(qū)域出現(xiàn)了大量eGFP+細胞，表明父本Pw1等位基因在損傷部位被激活。免疫染色顯示eGFP主要在梗死區(qū)域的PDGFRa+成纖維細胞中表達。接下來，作者檢測了Pw1^p+/mCreER小鼠MI后的母本等位基因Pw1。結(jié)果顯示，母本Pw1等位基因也在梗死區(qū)域的PDGFRa+成纖維細胞中被激活。這些結(jié)果表明，在MI后梗死區(qū)域兩個Pw1等位基因都被激活。此外，qPCR結(jié)果顯示，梗死區(qū)域父系和母系兩個Pw1等位基因的mRNA水平均顯著高于遠端區(qū)域。

鑒于Pw1在損傷區(qū)域的表達上調(diào)，作者接下來探究了Pw1在MI后心臟修復中的功能。首先，作者評估了Pw1^p+/m+（野生型）、Pw1^p+/mCreER（母本失活）、Pw1^pCreER/m+（父本失活）和Pw1^{pCreER/mCreER}（Pw1 KO）小鼠在損傷前和損傷后的心臟功能。結(jié)果表明，與對照組相比，MI后28天，Pw1^pCreER/m+和Pw1 KO小鼠心臟功能（射血分數(shù)、縮短分數(shù)、收縮末期容積、舒張末期容積、左心室收縮末期維度和舒張末期維度）有所改善；而在Pw1^p+/mCreER小鼠中未觀察到改善現(xiàn)象。以上結(jié)果表明父本等位基因在MI后心臟功能中的具有主要作用。

隨后對心臟進行天狼星紅染色分析。結(jié)果表明，與WT對照相比，Pw1^pCreER/m+和Pw1 KO小鼠的替代和間質(zhì)纖維化區(qū)域更小，而血管周圍纖維化區(qū)域沒有顯著差異。對左心室中幾種ECM基因的表達水平進行分析，結(jié)果顯示，Col1a1、Col1a2、Col3a1、Col4a1、Col6a1和Fn1的表達水平在Pw1 KO小鼠中下調(diào)；編碼肌成纖維細胞標記物Acta2在Pw1 KO組中也較低。且Pw1 KO小鼠損傷的左心室中FN1蛋白表達水平降低。這些結(jié)果提示，Pw1缺失可增強心肌梗死后的心臟功能，降低心肌纖維化程度。

PDGFRa是成年小鼠心臟中成纖維細胞的標志物。作者將Pw1^fl/fl與Pdgfra-Cre小鼠交配，獲得了成纖維細胞特異性敲除Pw1（Pdgfra-Cre;Pw1^fl/fl）的小鼠。與對照組相比，MI后Pw1 CKO小鼠的射血分數(shù)、縮短分數(shù)、收縮末期容積和舒張末期容積相較于對照組有所改善，替代性和間質(zhì)性纖維化區(qū)域更小。Pw1 CKO小鼠損傷心臟組織中ECM基因、Acta2基因的mRNA水平及FN1蛋白表達水平均顯著降低。以上結(jié)果表明Pw1在PDGFRa+細胞中的缺失改善了小鼠MI后的心臟功能并減少了纖維化。

接下來作者探究了Pw1對成纖維細胞ECM基因調(diào)節(jié)作用。通過RNA-seq富集到了細胞組分ECM中富集182個DEGs（Pw1?CKO組下調(diào)135個，上調(diào)47個），表明成纖維細胞中大多數(shù)ECM DEGs表達水平因Pw1缺失而降低。通過RNA-seq分析，找到了在Pw1 CKO成纖維細胞中找到了10640個差異表達基因（DEGs），其中5329個上調(diào)，5311個下調(diào)。進一步GO分析結(jié)果表明，在ECM中富集了182個DEGs(與對照組相比，Pw1 CKO組中135個下調(diào)，47個上調(diào)）。以上結(jié)果表明，Pw1的缺失抑制了MI后心臟成纖維細胞中許多ECM基因的表達。

作者接著探究了Pw1的靶基因。通過一系列的高通量測序及實驗驗證，結(jié)果表明，Pfas（編碼DNPB酶PFAS）是損傷后心臟中PW1的直接靶標。

為進一步證明Pfas是否是Pw1在成纖維細胞中調(diào)節(jié)ECM基因所必需的，作者將Pdgfra-CreER小鼠（由南模生物提供）與Pfas^fl/fl交配獲得了Pfas CKO（PDGFRa-CreER;Pfas^fl/fl）及對照（PDGFRa-CreER;Pfas^fl/+）小鼠。qPCR結(jié)果表明，Pfas CKO成纖維細胞中Pfas顯著缺失，同時幾個ECM基因減少。上述結(jié)果提示Pw1通過在損傷后心肌成纖維細胞中調(diào)節(jié)Pfas來調(diào)控ECM基因表達。

由于Pfas編碼DNPB途徑中的酶PFAS，作者假設PW1可能調(diào)節(jié)心臟成纖維細胞中的嘌呤合成，接下來對此進行了驗證。作者對過表達Pw1和野生型的心臟成纖維細胞進行代謝組學分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在Pw1過表達組中，參與嘌呤代謝途徑的代謝物，包括IMP、AMP、肌苷和腺嘌呤表達上調(diào)，而在嘧啶代謝途徑中，僅有尿嘧啶表達上調(diào)。此外過表達Pw1的活化成纖維細胞中的AMP濃度顯著升高。這些結(jié)果表明，PW1增強了激活的心臟成纖維細胞中的嘌呤合成。

Fig6. PW1促進活化的心臟成纖維細胞中嘌呤的生物合成。

Pfas對于Pw1介導的ECM產(chǎn)生至關(guān)重要，并且其過表達增加了激活的心臟成纖維細胞中ECM基因和Acta2的表達。因此，作者假設DNPB途徑可能對于這些細胞中ECM的產(chǎn)生至關(guān)重要。為驗證這一假設，作者利用兩種DNPB抑制劑處理細胞（6-巰基嘌呤和LSN3213128）。結(jié)果表明，幾個ECM基因的表達水平降低，即DNPB途徑對于激活的成纖維細胞中ECM基因的表達是必需的。

最后，作者評估了Pfas在體內(nèi)成纖維細胞中的作用。作者在Pfas CKO小鼠中通過通過永久結(jié)扎左前降支（LAD）冠狀動脈誘導MI。心肌梗死后28天的超聲心動圖評估顯示Pfas CKO小鼠的心功能指標得到了改善，且替代區(qū)和間質(zhì)纖維化區(qū)都較小。

與前述一致，作者進行了RNA-seq分析，結(jié)果表明Pfas的缺失顯著影響了心肌梗死后心肌成纖維細胞中纖維化相關(guān)基因的表達水平。

Fig7. 成纖維細胞中Pfas的失活可改善心肌梗死后的心臟功能并限制心肌纖維化.