2024年9月25日，上海科技大學(xué)張輝、同濟(jì)大學(xué)唐娟、復(fù)旦大學(xué)劉琛共同通訊在Circulation（IF=35.5）雜志上在線發(fā)表了題為“Activation of Imprinted Gene PW1 Promotes Cardiac Fibrosis After Ischemic Injury”的研究論文。該研究表明印跡基因PW1的激活促進(jìn)缺血性損傷后心臟纖維化。

印記基因是一類特殊的基因，它們僅表達(dá)來(lái)自父母一方的等位基因，而另一方的等位基因則不表達(dá)。這種表達(dá)模式的調(diào)控機(jī)制主要包括DNA甲基化、組蛋白修飾以及長(zhǎng)鏈非編碼RNA的作用等。近年來(lái)的研究表明，印記基因在多種生物學(xué)過(guò)程中發(fā)揮著重要作用，尤其是在胚胎心臟發(fā)育和先天性心臟病的發(fā)生中扮演著關(guān)鍵角色。盡管如此，關(guān)于印記基因是否參與成年心臟損傷后的再生和修復(fù)過(guò)程，目前的研究還相對(duì)較少。

心臟纖維化以心肌細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）沉積過(guò)多為特征，是心臟病治療的重要目標(biāo)。PW1（父系表達(dá)基因3）是一個(gè)由父系等位基因表達(dá)的印跡基因，從頭嘌呤生物合成（DNPB）是核苷酸合成的重要途徑。然而，PW1和DNPB在心肌缺血時(shí)心肌成纖維細(xì)胞產(chǎn)生ECM中的作用尚不清楚。

為評(píng)估Pw1的父本和母本等位基因的表達(dá)情況，作者構(gòu)建了Pw1^{CreER-2A-eGFP}（Pw1^CreER）小鼠。并通過(guò)將雄性雜合子Pw1^CreER/+小鼠與雌性Rosa26-loxp-stop-loxp-tdTomato（R26-tdTomato）報(bào)告小鼠交配獲得Pw1^pCreER/m+;R26-tdTomato小鼠。雌性雜合子Pw1^CreER/+小鼠與雄性R26-tdTomato報(bào)告小鼠雜交獲得Pw1^p+/mCreER;R26-tdTomato小鼠。結(jié)果表明，在Pw1^pCreER/m+; R26-tdTomato小鼠的腸道、骨骼肌、胃、肺和心臟中觀察到強(qiáng)的tdTomato信號(hào)，并且發(fā)現(xiàn)在心房中tdTomato表達(dá)水平高，而心室中表達(dá)水平較低。相比之下，在Pw1^p+/mCreER;R26-tdTomato小鼠的器官中未檢測(cè)到tdTomato信號(hào)。以上結(jié)果提示，Pw1只有父本等位基因在正常成年小鼠心臟中是活躍的。

Fig1. Pw1父本等位基因在正常成年小鼠心臟中活躍。

接下來(lái)，作者探究了在通過(guò)結(jié)扎左前降支（LAD）冠狀動(dòng)脈誘導(dǎo)的心肌梗死（myocardial?

Infarction，MI）心臟中Pw1等位基因的表達(dá)。結(jié)果表明，與假手術(shù)心臟的心室相比，梗死區(qū)域出現(xiàn)了大量eGFP+細(xì)胞，表明父本Pw1等位基因在損傷部位被激活。免疫染色顯示eGFP主要在梗死區(qū)域的PDGFRa+成纖維細(xì)胞中表達(dá)。接下來(lái)，作者檢測(cè)了Pw1^p+/mCreER小鼠MI后的母本等位基因Pw1。結(jié)果顯示，母本Pw1等位基因也在梗死區(qū)域的PDGFRa+成纖維細(xì)胞中被激活。這些結(jié)果表明，在MI后梗死區(qū)域兩個(gè)Pw1等位基因都被激活。此外，qPCR結(jié)果顯示，梗死區(qū)域父系和母系兩個(gè)Pw1等位基因的mRNA水平均顯著高于遠(yuǎn)端區(qū)域。

鑒于Pw1在損傷區(qū)域的表達(dá)上調(diào)，作者接下來(lái)探究了Pw1在MI后心臟修復(fù)中的功能。首先，作者評(píng)估了Pw1^p+/m+（野生型）、Pw1^p+/mCreER（母本失活）、Pw1^pCreER/m+（父本失活）和Pw1^{pCreER/mCreER}（Pw1 KO）小鼠在損傷前和損傷后的心臟功能。結(jié)果表明，與對(duì)照組相比，MI后28天，Pw1^pCreER/m+和Pw1 KO小鼠心臟功能（射血分?jǐn)?shù)、縮短分?jǐn)?shù)、收縮末期容積、舒張末期容積、左心室收縮末期維度和舒張末期維度）有所改善；而在Pw1^p+/mCreER小鼠中未觀察到改善現(xiàn)象。以上結(jié)果表明父本等位基因在MI后心臟功能中的具有主要作用。

隨后對(duì)心臟進(jìn)行天狼星紅染色分析。結(jié)果表明，與WT對(duì)照相比，Pw1^pCreER/m+和Pw1 KO小鼠的替代和間質(zhì)纖維化區(qū)域更小，而血管周圍纖維化區(qū)域沒(méi)有顯著差異。對(duì)左心室中幾種ECM基因的表達(dá)水平進(jìn)行分析，結(jié)果顯示，Col1a1、Col1a2、Col3a1、Col4a1、Col6a1和Fn1的表達(dá)水平在Pw1 KO小鼠中下調(diào)；編碼肌成纖維細(xì)胞標(biāo)記物Acta2在Pw1 KO組中也較低。且Pw1 KO小鼠損傷的左心室中FN1蛋白表達(dá)水平降低。這些結(jié)果提示，Pw1缺失可增強(qiáng)心肌梗死后的心臟功能，降低心肌纖維化程度。

PDGFRa是成年小鼠心臟中成纖維細(xì)胞的標(biāo)志物。作者將Pw1^fl/fl與Pdgfra-Cre小鼠交配，獲得了成纖維細(xì)胞特異性敲除Pw1（Pdgfra-Cre;Pw1^fl/fl）的小鼠。與對(duì)照組相比，MI后Pw1 CKO小鼠的射血分?jǐn)?shù)、縮短分?jǐn)?shù)、收縮末期容積和舒張末期容積相較于對(duì)照組有所改善，替代性和間質(zhì)性纖維化區(qū)域更小。Pw1 CKO小鼠損傷心臟組織中ECM基因、Acta2基因的mRNA水平及FN1蛋白表達(dá)水平均顯著降低。以上結(jié)果表明Pw1在PDGFRa+細(xì)胞中的缺失改善了小鼠MI后的心臟功能并減少了纖維化。

接下來(lái)作者探究了Pw1對(duì)成纖維細(xì)胞ECM基因調(diào)節(jié)作用。通過(guò)RNA-seq富集到了細(xì)胞組分ECM中富集182個(gè)DEGs（Pw1?CKO組下調(diào)135個(gè)，上調(diào)47個(gè)），表明成纖維細(xì)胞中大多數(shù)ECM DEGs表達(dá)水平因Pw1缺失而降低。通過(guò)RNA-seq分析，找到了在Pw1 CKO成纖維細(xì)胞中找到了10640個(gè)差異表達(dá)基因（DEGs），其中5329個(gè)上調(diào)，5311個(gè)下調(diào)。進(jìn)一步GO分析結(jié)果表明，在ECM中富集了182個(gè)DEGs(與對(duì)照組相比，Pw1 CKO組中135個(gè)下調(diào)，47個(gè)上調(diào)）。以上結(jié)果表明，Pw1的缺失抑制了MI后心臟成纖維細(xì)胞中許多ECM基因的表達(dá)。

作者接著探究了Pw1的靶基因。通過(guò)一系列的高通量測(cè)序及實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，結(jié)果表明，Pfas（編碼DNPB酶PFAS）是損傷后心臟中PW1的直接靶標(biāo)。

為進(jìn)一步證明Pfas是否是Pw1在成纖維細(xì)胞中調(diào)節(jié)ECM基因所必需的，作者將Pdgfra-CreER小鼠（由南模生物提供）與Pfas^fl/fl交配獲得了Pfas CKO（PDGFRa-CreER;Pfas^fl/fl）及對(duì)照（PDGFRa-CreER;Pfas^fl/+）小鼠。qPCR結(jié)果表明，Pfas CKO成纖維細(xì)胞中Pfas顯著缺失，同時(shí)幾個(gè)ECM基因減少。上述結(jié)果提示Pw1通過(guò)在損傷后心肌成纖維細(xì)胞中調(diào)節(jié)Pfas來(lái)調(diào)控ECM基因表達(dá)。

由于Pfas編碼DNPB途徑中的酶PFAS，作者假設(shè)PW1可能調(diào)節(jié)心臟成纖維細(xì)胞中的嘌呤合成，接下來(lái)對(duì)此進(jìn)行了驗(yàn)證。作者對(duì)過(guò)表達(dá)Pw1和野生型的心臟成纖維細(xì)胞進(jìn)行代謝組學(xué)分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在Pw1過(guò)表達(dá)組中，參與嘌呤代謝途徑的代謝物，包括IMP、AMP、肌苷和腺嘌呤表達(dá)上調(diào)，而在嘧啶代謝途徑中，僅有尿嘧啶表達(dá)上調(diào)。此外過(guò)表達(dá)Pw1的活化成纖維細(xì)胞中的AMP濃度顯著升高。這些結(jié)果表明，PW1增強(qiáng)了激活的心臟成纖維細(xì)胞中的嘌呤合成。

Fig6. PW1促進(jìn)活化的心臟成纖維細(xì)胞中嘌呤的生物合成。

Pfas對(duì)于Pw1介導(dǎo)的ECM產(chǎn)生至關(guān)重要，并且其過(guò)表達(dá)增加了激活的心臟成纖維細(xì)胞中ECM基因和Acta2的表達(dá)。因此，作者假設(shè)DNPB途徑可能對(duì)于這些細(xì)胞中ECM的產(chǎn)生至關(guān)重要。為驗(yàn)證這一假設(shè)，作者利用兩種DNPB抑制劑處理細(xì)胞（6-巰基嘌呤和LSN3213128）。結(jié)果表明，幾個(gè)ECM基因的表達(dá)水平降低，即DNPB途徑對(duì)于激活的成纖維細(xì)胞中ECM基因的表達(dá)是必需的。

最后，作者評(píng)估了Pfas在體內(nèi)成纖維細(xì)胞中的作用。作者在Pfas CKO小鼠中通過(guò)通過(guò)永久結(jié)扎左前降支（LAD）冠狀動(dòng)脈誘導(dǎo)MI。心肌梗死后28天的超聲心動(dòng)圖評(píng)估顯示Pfas CKO小鼠的心功能指標(biāo)得到了改善，且替代區(qū)和間質(zhì)纖維化區(qū)都較小。

與前述一致，作者進(jìn)行了RNA-seq分析，結(jié)果表明Pfas的缺失顯著影響了心肌梗死后心肌成纖維細(xì)胞中纖維化相關(guān)基因的表達(dá)水平。

Fig7. 成纖維細(xì)胞中Pfas的失活可改善心肌梗死后的心臟功能并限制心肌纖維化.