PART1 什么是免疫系統(tǒng)人源化小鼠模型

免疫系統(tǒng)人源化小鼠模型是通過將人的造血細(xì)胞、淋巴細(xì)胞或組織植入免疫缺陷小鼠體內(nèi)，從而使其重建人類免疫系統(tǒng)的小鼠模型。它們可有效地重建人類免疫系統(tǒng)，更好地模擬人體免疫特征。

為什么需要免疫系統(tǒng)人源化小鼠

近交系小鼠由于其具有遺傳背景一致、繁殖周期短并且基因修飾操作手段成熟等優(yōu)勢，已成為免疫學(xué)研究的重要動物模型。但是，畢竟嚙齒動物和人類之間存在巨大的種屬差異，人類病原體或針對人類細(xì)胞開發(fā)的藥物也具有種屬特異性，在免疫健全的小鼠模型中無法很好的模擬疾病的發(fā)生發(fā)展。野生型小鼠的免疫系統(tǒng)對于來源于人的異種細(xì)胞和組織具有很強(qiáng)的排斥作用。而依賴于免疫缺陷小鼠的人腫瘤移植模型雖然已被廣泛使用在腫瘤免疫及新療法研發(fā)中，但由于缺乏人類免疫系統(tǒng)及腫瘤免疫微環(huán)境，很大程度上限制了免疫機(jī)制及免疫治療的轉(zhuǎn)化研究。因此，如何利用動物模型模擬人體腫瘤細(xì)胞與免疫系統(tǒng)之間的相互作用，也成為腫瘤免疫研究中至關(guān)重要的一環(huán)。

免疫系統(tǒng)人源化小鼠模型具有人類免疫系統(tǒng)、能夠模仿人體免疫機(jī)能和病理表現(xiàn)的人源化小鼠模型對于研究人類疾病和新型療法的開發(fā)具有重要意義。

免疫系統(tǒng)人源化小鼠的宿主

應(yīng)該說，免疫系統(tǒng)人源化小鼠模型建立的前提是免疫缺陷小鼠的構(gòu)建和不斷優(yōu)化發(fā)展。因?yàn)橹挥惺紫绕茐氖荏w小鼠的自身免疫系統(tǒng)，移植到其體內(nèi)的人源組織或者細(xì)胞才能重建出具有功能的人源免疫系統(tǒng)

從最早的裸鼠（nude），到后來的SCID小鼠和Rag-/-小鼠，再到NOD-scid小鼠，這些早期的免疫缺陷小鼠或由于固有免疫的存在導(dǎo)致人源細(xì)胞的植入成功率低，或由于對輻照高度敏感以及有限的生命周期，均不同程度地限制了免疫系統(tǒng)人源化小鼠在實(shí)際研究中的應(yīng)用。

免疫缺陷小鼠的發(fā)展在2000年后迎來了里程碑式的突破。人們發(fā)現(xiàn)，干擾白細(xì)胞介素2 (IL-2)受體γ鏈(IL-2Rγc)的缺失不僅會導(dǎo)致小鼠T、B細(xì)胞發(fā)生嚴(yán)重缺陷，而且會干擾NK細(xì)胞的發(fā)育，從而能夠進(jìn)一步改善人源細(xì)胞在小鼠體內(nèi)的移植效果。在此基礎(chǔ)上，多種更為先進(jìn)的重癥免疫缺陷小鼠被世界各地的研究人員繁育出來，成為目前被廣泛應(yīng)用的免疫系統(tǒng)人源化小鼠模型宿主。包括：BALB/c-Rag2-/-γc-/-(BRG)、NOD/shi-SCID γc-/-? (NOG) 以及?NOD/SCID-γc-/-?(NSG)等等。

表1.?人源化小鼠模型的宿主及其特點(diǎn) （表格來自Ref.6 ）

建立免疫系統(tǒng)人源化小鼠模型的方法

依據(jù)人免疫系統(tǒng)重建的方法，可以將免疫系統(tǒng)人源化小鼠模型分為三大類：

• Hu-PBMC (也叫 Hu-PBL) 小鼠模型?（humanized-peripheral blood mononuclear cells）

• Hu-HSC 小鼠模型?( humanized-hematopoietic stem cells )

• Hu-BLT 小鼠模型?( humanized-bone marrow, liver, thymus )

1）?Hu-PBMC 小鼠模型

外周血單核細(xì)胞（Peripheral blood mononuclear cell, PBMC) 即外周血中具有單個核的細(xì)胞，主要由淋巴細(xì)胞（T或B細(xì)胞）、單核細(xì)胞、吞噬細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞和其他少量細(xì)胞類型組成，是機(jī)體免疫應(yīng)答功能的重要細(xì)胞組成。

Hu-PBMC 模型，或者被稱為?Hu-PBL（perihperal blood lymphocyte, PBL）模型，是一種構(gòu)建較為簡單和經(jīng)濟(jì)的免疫系統(tǒng)人源化小鼠模型。其構(gòu)建方式是將成熟淋巴細(xì)胞（來自PBMC）經(jīng)腹腔（i.p.）或靜脈（i.v.）注射到免疫缺陷宿主小鼠中，該模型常被用于研究人效應(yīng)T細(xì)胞的活化以及評估免疫抑制藥物。

圖1.?Hu-PBMC模型的構(gòu)建示意圖。（圖片來自Ref.2?）

Hu-PBMC 模型的準(zhǔn)備期較短。在移植PBMC后，最快一周就可以檢測到人CD3+ T細(xì)胞；大約2周左右，免疫細(xì)胞就會快速重建；大約4周左右，小鼠外周血中可檢測到約50%的人CD45+細(xì)胞，其中約90%為CD3+ T細(xì)胞，CD4+:CD8+?T細(xì)胞比率約為1:1。但是，Hu-PBMC模型會發(fā)生致死性的移植物抗宿主?。℅vHD），程度與人T細(xì)胞的植入直接相關(guān)，可以通過小鼠體重的減輕來評估。一般移植后2-3周就會出現(xiàn)GvHD，因此實(shí)驗(yàn)觀察窗較短。

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圖2.?Hu-PBMC免疫系統(tǒng)人源化小鼠的免疫重建情況與GvHD發(fā)展。（A）人源化小鼠中靜脈注射（i.v.）人外周血單核細(xì)胞（PBMC）后的重建。 （B）人源化小鼠中注射PBMC后的造血重建和GvHD發(fā)展。 PBMC注射后2至4周，血液中人CD45+細(xì)胞增加，同時小鼠發(fā)生GvHD，體重快速嚴(yán)重減輕。（Ref.2?）

2）?Hu-HSC 小鼠模型

另一類方法則是將人CD34+ HSCs注射到免疫缺陷宿主小鼠中，該方法需要首先對宿主小鼠進(jìn)行亞致死劑量的輻照以消除小鼠HSC并促進(jìn)人HSC的移植。此類模型也叫 hu-CD34+ ，或叫 hu-SRC（scid-repopulating cell）模型，已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于研究人類造血發(fā)育、細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)以及HIV和EBV等病毒感染性疾病中。

造血干細(xì)胞（Hematopoietic stem cell, HSC）是人體造血組織中能自我更新, 又能分化產(chǎn)生各系血細(xì)胞的一類細(xì)胞。CD34抗原是人們普遍認(rèn)同的造血干/祖細(xì)胞的代表性表面標(biāo)志, 它是一個高度糖基化的I型跨膜糖蛋白, 具有調(diào)節(jié)細(xì)胞粘附性的作用, 能促進(jìn)細(xì)胞對骨髓基質(zhì)的粘附。

通過靜脈內(nèi)（i.v.）或股骨內(nèi)（i.f.）將來自人臍帶血、骨髓、G-CSF激活的外周血或胎肝的人CD34+?HSCs注射到成年免疫缺陷小鼠中，可以產(chǎn)生多種造血干細(xì)胞，但T細(xì)胞產(chǎn)生量少，不具備功能性免疫細(xì)胞。或通過靜脈注射（心內(nèi)或肝內(nèi)）將人CD34+?HSCs移植到新生受體小鼠中（小于4周齡），得到良好的人細(xì)胞移植，并且產(chǎn)生T細(xì)胞、B細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、NK細(xì)胞和DC細(xì)胞。胚胎肝臟和臍帶血是最常用的人CD34+?HSCs來源，其較成年人HSCs更易定植于免疫缺陷小鼠。

圖3.?Hu-HSC模型構(gòu)建示意圖。（圖片來自Ref.2?）

目前認(rèn)為Hu-HSC 模型是最適于研究免疫治療的動物模型之一，其能建立人的固有免疫系統(tǒng)和淋巴細(xì)胞，通常不發(fā)生或輕微發(fā)生GvHD，可用于長期研究。不過也存在一定的局限性，例如，人T細(xì)胞在小鼠的胸腺內(nèi)發(fā)育成熟，小鼠的主要組織相容性復(fù)合體（MHC）稱為H2復(fù)合體，因此T細(xì)胞是小鼠H2限制性，而不表達(dá)人類白細(xì)胞抗原（HLA）。另外，由于人和小鼠之間的種屬差異，小鼠體內(nèi)缺乏人的細(xì)胞因子，人類干細(xì)胞在小鼠體內(nèi)發(fā)育受限。

圖4.?HuCD34+ HSCs免疫系統(tǒng)人源化小鼠的免疫重建情況。（圖片來自Ref.2?）

3）?Hu-?BLT?小鼠模型

該模型是將免疫缺陷小鼠經(jīng)亞致死劑量輻照處理后，將人胎肝和胸腺組織移植到成年免疫缺陷受體小鼠腎包膜下，同時將來自同一個體的胎肝或骨髓來源 CD34+ HSCs?通過靜脈注射（i.v.）給受體小鼠。

圖5.?Hu-?BLT模型構(gòu)建示意圖。（圖片來自Ref.2?）

移植的人胎肝和胸腺提供了人胸腺微環(huán)境，以支持人T細(xì)胞的發(fā)育分化，包含多種多樣的HLA限制T細(xì)胞，可以建立有效的適應(yīng)性免疫反應(yīng)。因此，BLT 模型多用于適應(yīng)性免疫反應(yīng)的研究，如HIV感染。然而，BLT 模型的GvHD的發(fā)生率高于其他CD34+ HSC移植模型，也限制了該類模型的研究窗口。另外，由于操作上很難實(shí)現(xiàn)同一供者的腫瘤細(xì)胞和免疫系統(tǒng)相匹配，且Hu-BLT 模型建立過程中需要復(fù)雜精細(xì)的手術(shù)操作，也限制了Hu-BLT模型在腫瘤免疫藥物研發(fā)中的應(yīng)用。

小結(jié)

我們可以用以下兩張表格來大致歸納上述3種免疫系統(tǒng)人源化小鼠模型。

表2.?3種免疫系統(tǒng)人源化小鼠模型的優(yōu)缺點(diǎn)比較

表3.?Hu-PBMC 模型 vs?Hu-HSC?模型

PART2 免疫系統(tǒng)人源化小鼠在人類疾病與生理研究中的應(yīng)用

移植相關(guān)研究

深入了解同種異體移植排斥的機(jī)制對于開發(fā)新的免疫療法以改善器官移植的長期效果至關(guān)重要。但由于小鼠和人類免疫反應(yīng)之間存在許多物種特異性差異，導(dǎo)致在動物模型中成功的療法在臨床轉(zhuǎn)化中遇到許多困難。而免疫系統(tǒng)人源化小鼠成為了研究同種異體移植排斥的機(jī)制、分子途徑研究以及潛在療法評估的重要模型。

移植物抗宿主病?GVHD

早前在免疫缺陷小鼠中對人CD4+ Treg進(jìn)行的體內(nèi)研究表明，人CD4+ Treg可預(yù)防人皮膚異體移植的排斥反應(yīng)和移植動脈粥樣硬化的發(fā)展。但由于免疫缺陷小鼠沒有穩(wěn)定的人類免疫系統(tǒng)，因此尚不清楚這些結(jié)果與人類疾病的相關(guān)性?；贖u-PBMC模型建立的急性人類同種異體GVHD模型可用于研究了CD8hi?Tregs在體內(nèi)預(yù)防GVHD的治療潛力。研究表明，人類CD8hi Tregs可以通過減少異體反應(yīng)性T細(xì)胞增殖、以及CTLA-4依賴性靶器官內(nèi)炎癥性細(xì)胞因子的分泌，減輕急性GVHD反應(yīng)。且這些CD8hi?Tregs可以有效誘導(dǎo)長期耐受，而不會損害Hu-PBMC小鼠的一般免疫力和移植物抗腫瘤（GVT）活性。

圖6. CD8hi?Tregs inhibit human allogeneic acute GVHD in an allospecific manner in vivo. （Ref.20）

皮膚移植

在NSG小鼠中進(jìn)行人皮膚移植，發(fā)現(xiàn)小鼠抗粒細(xì)胞受體1抗體（anti-Gr1）治療可以減少Gr1+細(xì)胞浸潤，保留移植內(nèi)皮，并促進(jìn)傷口愈合，具有良好的血管生成與血管形態(tài)，改善組織發(fā)育和移植重構(gòu)。但在CD4+或CD8+同種異體人PBMC注射后，已愈合的人類皮膚移植物在21天內(nèi)被排斥，這為研究人類T細(xì)胞介導(dǎo)的皮膚同種異體排斥提供了可靠且可復(fù)制的模型。

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圖7.?Rejected Human Skin Allografts Anti-Gr1 mAb-treated NSG mice bearing human skin grafts for ~30 days were left untreated (top rows) or injected intravenously with 20×106 allogeneic human PBMC (bottom rows) and tissues were recovered from both groups 31 days later.?（Ref.21）

胰島移植

Hu-PBMC模型已被用于研究胰島排斥反應(yīng)，但是在胰島排斥反應(yīng)和GVHD發(fā)生之間存在“競爭“，難以長期監(jiān)測治療效果。同種異體PBMC與胰島移植物同時注射到NSG小鼠中可導(dǎo)致100％的小鼠在21天之內(nèi)迅速發(fā)生移植物排斥反應(yīng)并恢復(fù)高血糖。而在同種異體PBMC注射前37天，在糖尿病NSG小鼠中建立胰島移植，由于GVHD的發(fā)展，在研究終止之前，三分之二的小鼠恢復(fù)了高血糖。

Hu-HSC模型可建立更完整的免疫系統(tǒng)，但不同免疫缺陷小鼠受體的選擇可能會影響移植的結(jié)果。移植同種異體人類胰島后，植入HSC的高血糖BRG小鼠不排斥人胰島，且極少T細(xì)胞滲入移植物。而NSG-HSC小鼠中移植物排斥率約為60%，且移植物中單核細(xì)胞浸潤嚴(yán)重。此外，研究還發(fā)現(xiàn)植入的人HSC數(shù)量差異也會導(dǎo)致免疫系統(tǒng)人源化小鼠胰島移植模型中人免疫功能的差異，見下圖。

圖8.?Recipient strain and engraftment protocols affect islet allograft survival in humanized mice.?（Ref.17）

傳染性疾病

免疫系統(tǒng)人源化小鼠在研究人類病原體中具有廣泛應(yīng)用，包括病毒（HIV、愛潑斯坦巴爾病毒、巨細(xì)胞病毒和登革熱），細(xì)菌（腸炎沙門氏菌血清型傷寒、結(jié)核分枝桿菌、金黃色葡萄球菌等）和寄生蟲（惡性瘧原蟲、大利什曼原蟲）感染。

圖9.?免疫系統(tǒng)人源化小鼠在研究人類病原體中的應(yīng)用（Ref.10 ）

EBV

愛潑斯坦巴爾病毒（EBV）是世界上最普遍的人類病原體之一，持續(xù)感染90％以上的成年人口。由于EBV對人類細(xì)胞具有種屬特異性，因此過去對該病毒的研究僅限于體外系統(tǒng)。但隨著免疫系統(tǒng)人源化小鼠的產(chǎn)生，使對于EBV的研究得以在體內(nèi)展開。

將HLA-A2?+?CD34?+造血祖細(xì)胞注射到NSG小鼠中重建人源免疫系統(tǒng)，如下圖所示。在這些Hu-HSC模型中獲得平均65％的CD45?+重組，約40％的CD3?+?T細(xì)胞，約55％的CD19?+?B細(xì)胞，以及約3％的NKp46?+?NK細(xì)胞。其中T細(xì)胞大約由25％的CD8?+?T細(xì)胞和75％的CD4?+?T細(xì)胞組成。再用EBV感染免疫系統(tǒng)人源化小鼠，并對其進(jìn)行為期5周的追蹤。研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，即使CD8+ T細(xì)胞在原發(fā)性EBV感染過程中表達(dá)包括PD-1在內(nèi)的多種抑制性受體，但它們?nèi)员Ａ袅水a(chǎn)生細(xì)胞因子、殺死被感染細(xì)胞和增殖的能力。而用抗體阻斷PD-1并不能改善HIS小鼠的EBV特異性免疫控制，反而會增加病毒相關(guān)的淋巴瘤形成，表明PD-1軸對于病毒控制很重要。這些發(fā)現(xiàn)與先前的研究相反?？梢?，基于免疫系統(tǒng)人源化小鼠模型的研究為理解EBV感染的免疫控制與協(xié)同抑制途徑提供了新的證據(jù)。

圖10.?將HLA-A2?+?CD34?+造血祖細(xì)胞注射到NSG小鼠中重建人源免疫系統(tǒng)（Ref.11）

HIV

免疫系統(tǒng)人源化小鼠不僅增進(jìn)了我們對HIV傳播、潛伏期和發(fā)病機(jī)理的了解，而且為抗病毒研究提供了前所未有的平臺。

利用免疫系統(tǒng)人源化小鼠模型，研究者得以進(jìn)一步探索有效的病毒特異性抗體和常規(guī)抗逆轉(zhuǎn)錄病毒療法。基于Hu-HSC小鼠模型的研究表明，靶向CCR5的抑制性藥物Maraviroc可預(yù)防HIV的傳播。同時，還研究了HIV特異性CD8+ T細(xì)胞和漿細(xì)胞樣DC（pDC）在病毒復(fù)制和免疫應(yīng)答激活中的關(guān)鍵作用，以及它們在靶向治療中的潛力。

圖11.?靶向CCR5的抑制性藥物Maraviroc對HIV的預(yù)防效果（Ref.14 ）

在針對I型干擾素的抗病毒研究中，在Hu-HSC小鼠中用單克隆抗體阻斷IFNα/β受體（IFNAR）信號傳導(dǎo)，從而減少了抗逆轉(zhuǎn)錄病毒治療過程中的免疫過度活化并改善了HIV特異性T細(xì)胞免疫反應(yīng)。阻斷I型干擾素還減少了淋巴組織中的持久性HIV病毒庫，延遲了抗逆轉(zhuǎn)錄病毒療法停止后病毒的反彈?？梢?，免疫系統(tǒng)人源化小鼠模型使研究人員可以直接在體內(nèi)比較不同的抗逆轉(zhuǎn)錄病毒藥物及其抑制HIV復(fù)制或阻止傳播的能力，以及耐藥性發(fā)展、相關(guān)的副作用和毒性。特別是在Hu-HSC和BLT小鼠體內(nèi)產(chǎn)生的人類免疫細(xì)胞可以更完全地重建陰道和直腸黏膜，這使研究人員能夠比以前更準(zhǔn)確地模擬人源化小鼠中HIV的黏膜傳播。

圖12.?IFNAR blockade during cART delays HIV-1 rebound after cART cessation. （Ref. 18）

在HIV抗體療法研究中，針對HIV的強(qiáng)粘膜抗體是預(yù)防性疫苗研究的主要目標(biāo)。免疫系統(tǒng)人源化小鼠對抗HIV的廣泛中和抗體（bNAbs）研發(fā)也具有重要意義。近年來，優(yōu)化的HIV雙特異性抗體（biNAbs）通過改造后的IgG3鉸鏈結(jié)構(gòu)增加Fab靈活性，合并來自兩個親本中和抗體的Fab片段，實(shí)現(xiàn)了更高效的病毒靶向。若biNAbs具有與HIV 包膜糖蛋白（Env）中兩個不同表位的Fab片段，可表現(xiàn)出協(xié)同活性，具有中和不同HIV分離物的廣泛能力和高效性。利用HIV感染的Hu-HSC小鼠模型評估該雙特異性抗體的體內(nèi)活性，并證明該抗體比親本抗體混合物更有效地降低了病毒載量。若biNAbs具有靶向人CD4或人CCR5受體的Fab片段和另一個靶向HIV Env的Fab片段，可使抗體集中在病毒進(jìn)入的確切位置，從而增強(qiáng)通過抗HIV Env臂介導(dǎo)的病毒中和作用。這些CD4-Env或CCR5-Env雙特異性抗體能更有效地抑制感染的Hu-HSC小鼠中的HIV病毒載量。并且，若在HIV感染前使用，具有預(yù)防感染HIV的效果。

圖13.?Testing bispecific antibodies in humanized mice. （Ref.12）

腫瘤免疫研究

與人類腫瘤共移植的免疫系統(tǒng)人源化小鼠模型是研發(fā)腫瘤免疫療法新策略的有效工具。在免疫系統(tǒng)人源化小鼠的基礎(chǔ)上植入人的腫瘤細(xì)胞（CDX）或腫瘤組織（PDX），能夠更好地模擬人體內(nèi)的腫瘤微環(huán)境，用于研究人類免疫系統(tǒng)環(huán)境下腫瘤的生長情況、評估抗腫瘤治療，尤其是免疫治療效果及相關(guān)作用機(jī)制。

圖14.?基于免疫系統(tǒng)人源化小鼠（Hu-HSC）的PDX模型。全身γ射線輻照NSG小鼠后，在第5周將人CD34 +造血干細(xì)胞（HSC）注射到NSG小鼠中。 通過流式細(xì)胞儀檢測小鼠外周血中分化的人CD45 +細(xì)胞百分比，監(jiān)測人HSCs的植入情況。然后將患者的腫瘤組織移植到免疫系統(tǒng)人源化小鼠中，并用于研究多種療法的功效。（Ref.22）

在Hu-PBMC 模型和 Hu-HSC模型上進(jìn)行腫瘤細(xì)胞或組織接種，建立荷瘤人源化小鼠模型，可以用于以下幾方面的腫瘤免疫治療研究：

評估基于細(xì)胞的免疫療法

免疫系統(tǒng)人源化小鼠模型為評估過繼細(xì)胞療效提供了有力工具。利用Hu-PBMC模型的研究提示了，靶向間皮素的CAR-T療法對惡性間皮瘤具有顯著抗腫瘤作用。這為后來首個獲FDA批準(zhǔn)的用于治療B細(xì)胞急性淋巴細(xì)胞白血病的CAR-T療法的誕生提供了有力支持。在Hu-PBMC卵巢癌 PDX 模型中, CD27能夠共刺激 CAR-T細(xì)胞，從而獲得更高的持久性和抗腫瘤活性。

此外，在NK細(xì)胞過繼性免疫療法的研究中，免疫系統(tǒng)人源化小鼠也已被應(yīng)用到包括膠質(zhì)母細(xì)胞瘤、卵巢癌、結(jié)腸直腸癌、胰腺癌等在內(nèi)的腫瘤中。

評估免疫檢查點(diǎn)抑制劑的治療效果

越來越多的研究表明，免疫系統(tǒng)人源化小鼠模型在免疫檢查點(diǎn)抑制劑研究中具有獨(dú)特優(yōu)勢。例如：在Hu-PBMC小鼠中接種KHOS細(xì)胞，建立免疫系統(tǒng)人源化骨肉瘤小鼠模型。并利用該模型證明PD-1抑制劑可有效抑制骨肉瘤肺轉(zhuǎn)移。在Hu-PBMC小鼠中接種人淋巴瘤SCC-3細(xì)胞或膠質(zhì)母細(xì)胞瘤U87細(xì)胞模型中，PD-1抗體可使腫瘤大小減少50%以上?？梢娒庖呦到y(tǒng)人源化小鼠荷瘤模型是評估免疫檢查點(diǎn)抑制劑的良好平臺。

圖15.?Inhibitory effect of anti-PD-1 on the growth of SCC-3 and U87 tumors in vivo.（Ref.23）

評估聯(lián)合治療的效果，例如：雙重檢查點(diǎn)抑制劑

Hu-PBMC小鼠中接種人結(jié)腸直腸HT-29細(xì)胞和胃癌組織，并給予urelumab（抗hCD137）或/和nivolumab（抗PD-1）治療，結(jié)果發(fā)現(xiàn)聯(lián)合治療或單抗單獨(dú)用藥均可使腫瘤生長減緩，聯(lián)合治療未明顯提高療效；且腫瘤移植物中分泌IFNγ的人T細(xì)胞的增加以及人Treg細(xì)胞減少。

圖16.?Immunostimulatory mAbs anti-hCD137 (urelumab) and anti-hPD-1 (nivolumab) alone or in combination show antitumor activity against a xenografted human colon cancer mediated by transferred allogeneic human PBMC.（Ref.24）

在EBV相關(guān)淋巴瘤的Hu-HSC模型中，PD-1和CTLA-4抑制劑的聯(lián)合用藥可有效抑制 EBV誘導(dǎo)的彌漫性大B細(xì)胞淋巴瘤的生長，且抗腫瘤效果優(yōu)于單藥治療。

圖17.?Combined PD-1/CTLA-4 blockade inhibits the growth of EBV-induced lymphomas in cord blood-humanized mice.?（Ref.25）

評估免疫綜合療法，例如：CAR-T與免疫檢查點(diǎn)抑制劑聯(lián)合治療

在基于Hu-PBMC的原位胸膜間皮瘤小鼠模型中，研究了PD-1介導(dǎo)的T細(xì)胞衰竭對靶向間皮素的CAR-T細(xì)胞的影響。結(jié)果表明，阻斷PD-1/PD-L1可以增強(qiáng)CD28共刺激的CAR-T細(xì)胞功效。

圖18.?Injection of PD-1–blocking antibody rescues M28z CAR T cells in vivo as shown by tumor BLI in a model treating established high tumor burdens with a single low dose of intrapleurally administered M28z CAR T cells. （Ref.26）

評價ADCC、雙特異性抗體等

在Hu-PBMC小鼠中進(jìn)行腎細(xì)胞癌（RCC）原位荷瘤，獲得的人源化荷瘤小鼠模型用于評估碳酸酐酶IX抗體（anti-CAIX）的抗腫瘤效果。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，anti-CAIX mAb能在體外通過NK細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性（ADCC），補(bǔ)體依賴性細(xì)胞毒性（CDC）和巨噬細(xì)胞介導(dǎo)的抗體依賴性細(xì)胞吞噬作用（ADCP）殺傷RCC。在體內(nèi)能夠介導(dǎo)體內(nèi)的人體免疫應(yīng)答，包括腫瘤浸潤NK細(xì)胞的活化和T細(xì)胞的活化，從而抑制CAIX+腫瘤的生長。

在Hu-HSC結(jié)腸癌小鼠模型中評價了雙特異性EpCAM/CD3抗體的效果；在Hu-PBMC?B細(xì)胞淋巴瘤模型中評價了雙特異性CD20/CD3抗體（REGN1979）對B細(xì)胞的定向殺傷，抑制了B細(xì)胞腫瘤的生長；在Hu-PBMC?卵巢癌臨床前模型中評估了雙特異性CD3/CLDN6抗體（6PHU3）靶向T細(xì)胞的免疫調(diào)節(jié)療效，6PHU3能有效動員表達(dá)CD3的靜止T細(xì)胞，可幾乎消除表達(dá)CLDN6的腫瘤。

圖19.?Effects of REGN1979 on tumor growth in?in vivo?mouse tumor models. （Ref.28）

PART 3? 免疫系統(tǒng)人源化小鼠模型的選擇與優(yōu)化

如果是短期藥效研究，如早期藥效篩選，且靶向T細(xì)胞或NK細(xì)胞，那么Hu-PBMC模型是非常理想的模型，因?yàn)镠u-PBMC模型在細(xì)胞移植后2周即可快速投入使用，但Hu-PBMC模型中B細(xì)胞重建情況較差，且發(fā)生GVHD會導(dǎo)致Hu-PBMC模型的有效窗口較短（大約僅15-20天）。為降低Hu-PBMC的GVHD發(fā)生，可以通過引入小鼠主要組織相容性復(fù)合體I類分子（B2M，beta-2 microglobulin）基因敲除，延長模型的生存周期，放大Hu-PBMC模型的使用窗口。

而對于長期研究或需要評估藥物作用于多種免疫細(xì)胞時，那么使用Hu-HSC模型是更好的選擇，可以評估藥物或治療方法的長期記憶效應(yīng)和長期抗腫瘤作用。雖然Hu-HSC模型的免疫重建周期要比Hu-PBMC模型長，但Hu-HSC模型中可重建起不同的淋系及髓系的細(xì)胞，且GVHD的發(fā)生非常輕微及延遲，因此對于復(fù)雜系統(tǒng)中的長期研究具有明顯優(yōu)勢。不過，Hu-HSC模型重建后的NK細(xì)胞比例是很低的，為了更接近于人體內(nèi)的細(xì)胞比例，可以通過腹腔注射重組人IL15來刺激重建后的NK細(xì)胞活化與分化。

有研究比較了Hu-PBMC與Hu-HSC模型在PD-L1/PD-1免疫檢查點(diǎn)靶向治療中的效果。在這兩種免疫系統(tǒng)重建小鼠中接種非小細(xì)胞肺癌模型，結(jié)果顯示，阻斷PD-L1/PD-1信號在Hu-PBMC中，較Hu-HSC，表現(xiàn)出更顯著的抗腫瘤效果。

為解決免疫系統(tǒng)人源化小鼠不能很好地體現(xiàn)腫瘤免疫療法在人體中的不良反應(yīng)，如神經(jīng)毒性、細(xì)胞因子釋放綜合征等，一些新的人源化小鼠模型也應(yīng)運(yùn)而生。如用于檢測細(xì)胞因子釋放綜合征的人源化小鼠模型：在Hu-PBMC小鼠中注射anti‐CD3 mAb（OKT3）或anti‐CD28 mAb （TGN1412）。 anti‐CD3 mAb可誘發(fā)急性臨床癥狀，如毛細(xì)血管擴(kuò)張，運(yùn)動不足和體溫過低。而TGN1412可導(dǎo)致小鼠體溫迅速下降并在2-6小時內(nèi)死亡。

隨著免疫系統(tǒng)人源化小鼠模型的應(yīng)用越來越廣泛和深入，我們也看到目前的模型中有許多局限性，包括GVHD的可能性及其隨之而來的并發(fā)癥、有限的生存期、人類免疫功能不完整，腸道相關(guān)淋巴組織的人細(xì)胞重組水平低，淋巴器官發(fā)育不全，淋巴結(jié)構(gòu)不發(fā)達(dá)等等。同時，不同人細(xì)胞或組織來源的移植物對于在小鼠體內(nèi)免疫系統(tǒng)重建的效果及對后續(xù)實(shí)驗(yàn)的影響，也需要研究者的仔細(xì)比較和謹(jǐn)慎選擇。下圖提示了未來免疫系統(tǒng)人源化小鼠模型的優(yōu)化方向。

圖20.?未來免疫系統(tǒng)人源化小鼠模型的發(fā)展與改進(jìn)方向。（Ref.30）

PART 4? 南模生物Hu-PBMC與Hu-HSC模型

HSC 人源化小鼠

PBMC 人源化小鼠

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