采用ES細胞打靶的方式，在Rag2基因ATG位點附近定點敲入loxP-EGFP-PolyA-loxP-Neo-loxP表達框，從而造成Rag2基因沉默。作為Rag2基因敲除小鼠，皮下接種肝癌組織塊和腫瘤細胞后能形成腫瘤，并且可以增長。由FACS檢測小鼠外周靜脈血中的T、B淋巴細胞生成量極低，與Nude小鼠T、B淋巴細胞產(chǎn)生量相當甚至更低，與野生型小鼠相比具有顯著性差異；而NK細胞含量并未降低。腫瘤組織HE染色病理切片結(jié)果顯示Rag1 KI小鼠和Nude小鼠腫瘤切片較為相似。該品系小鼠具有替代Nude，NOD-SCID小鼠作為腫瘤成瘤模型的潛力。

構(gòu)建策略

圖1 Rag2構(gòu)建策略圖。

Rag1、Rag2基因敲除小鼠表達驗證

圖2 4種小鼠外周血功能T、B淋巴細胞含量流式細胞術(shù)檢測結(jié)果。

通過流式細胞術(shù)對野生型C57BL/6J小鼠、NOD-SCID小鼠、Rag1-/-小鼠和Rag2-/-小鼠外周血中B細胞和T細胞的檢測結(jié)果表明：Rag1-/-小鼠和Rag2-/-小鼠中的T細胞和B細胞含量較野生型小鼠有顯著性降低（P<0.0001,圖1A），T細胞和B細胞含量分別約為野生型的5％和25％；較NOD-SCID小鼠雖然均值略有增高，但無顯著性差異(P>0.05，圖1B)。

圖3. Rag1-KO和Rag2-KO小鼠外周血中T 、B細胞缺失。

取Rag1-KO和Rag2-KO小鼠小鼠的外周血，通過FACS對其中T 、B和NK細胞的組成進行分析（A）并進行統(tǒng)計對比（B）。

圖4. Rag1-KO和Rag2-KO小鼠脾臟中T 、B細胞缺失。

取Rag1-KO和Rag2-KO小鼠小鼠的脾臟細胞，通過FACS對其中T 、B和NK細胞的組成進行分析（A）并進行統(tǒng)計對比（B）。

圖5. Rag1-KO和Rag2-KO小鼠胸腺中T 、B細胞缺失。

取Rag1-KO和Rag2-KO小鼠小鼠的胸腺細胞，通過FACS對其中T 、B和NK細胞的組成進行分析（A）并進行統(tǒng)計對比（B）。

圖6. Rag2敲除小鼠胸腺和脾臟中EGFP檢測。

結(jié)果顯示Rag2 KO小鼠胸腺和脾臟中有EGFP陽性的細胞，并且EGFP陽性細胞均為CD4陰性和CD8陰性細胞。

Rag1、Rag2基因敲除小鼠的成瘤實驗

圖7?不同背景小鼠接種A549腫瘤細胞成瘤性結(jié)果

將異源腫瘤細胞分別移植到Rag1-/-小鼠、Rag2-/-小鼠、NOD-SCID小鼠、BALB/c裸小鼠和野生型C57BL/6J小鼠上，觀察和比較腫瘤細胞移植后的生長。

結(jié)果顯示，在Rag1-/-和Rag2-/-背景小鼠上，移植腫瘤生長速度最快，且兩者之間無顯著性差異；在NOD-SCID背景小鼠上的腫瘤生長速度次之；然后是在BALB/c裸小鼠背景；而在C57BL/6J小鼠上則無腫瘤生成(圖2A)。Rag1-/-和Rag2-/-小鼠上的腫瘤，自腫瘤移植22 d后，顯著大于BALB/c裸小鼠和NOD-SCID小鼠上的腫瘤體積(圖2A)。

腫瘤組織切片的HE染色結(jié)果顯示，來自Rag1-/-和Rag2-/-小鼠上的移植腫瘤組織和其他品系小鼠上的移植腫瘤組織切片沒有顯著差異，各組小鼠腫瘤細胞均生長旺盛，腫瘤細胞大小不一，胞核形態(tài)比較類似，可見瘤組織均呈巢狀或片狀生長，細胞間微血管較豐富(圖2B)。

Rag1-/-和Rag2-/-小鼠相較于傳統(tǒng)的異源腫瘤移植受體小鼠品系BALB/cNu裸小鼠和NOD-SCID小鼠，腫瘤生長速度更快。