采用ES細(xì)胞打靶的方式，在Rag2基因ATG位點(diǎn)附近定點(diǎn)敲入loxP-EGFP-PolyA-loxP-Neo-loxP表達(dá)框，從而造成Rag2基因沉默。作為Rag2基因敲除小鼠，皮下接種肝癌組織塊和腫瘤細(xì)胞后能形成腫瘤，并且可以增長(zhǎng)。由FACS檢測(cè)小鼠外周靜脈血中的T、B淋巴細(xì)胞生成量極低，與Nude小鼠T、B淋巴細(xì)胞產(chǎn)生量相當(dāng)甚至更低，與野生型小鼠相比具有顯著性差異；而NK細(xì)胞含量并未降低。腫瘤組織HE染色病理切片結(jié)果顯示Rag1 KI小鼠和Nude小鼠腫瘤切片較為相似。該品系小鼠具有替代Nude，NOD-SCID小鼠作為腫瘤成瘤模型的潛力。

構(gòu)建策略

圖1 Rag2構(gòu)建策略圖。

Rag1、Rag2基因敲除小鼠表達(dá)驗(yàn)證

圖2 4種小鼠外周血功能T、B淋巴細(xì)胞含量流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果。

通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)對(duì)野生型C57BL/6J小鼠、NOD-SCID小鼠、Rag1-/-小鼠和Rag2-/-小鼠外周血中B細(xì)胞和T細(xì)胞的檢測(cè)結(jié)果表明：Rag1-/-小鼠和Rag2-/-小鼠中的T細(xì)胞和B細(xì)胞含量較野生型小鼠有顯著性降低（P<0.0001,圖1A），T細(xì)胞和B細(xì)胞含量分別約為野生型的5％和25％；較NOD-SCID小鼠雖然均值略有增高，但無(wú)顯著性差異(P>0.05，圖1B)。

圖3. Rag1-KO和Rag2-KO小鼠外周血中T 、B細(xì)胞缺失。

取Rag1-KO和Rag2-KO小鼠小鼠的外周血，通過(guò)FACS對(duì)其中T 、B和NK細(xì)胞的組成進(jìn)行分析（A）并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)對(duì)比（B）。

圖4. Rag1-KO和Rag2-KO小鼠脾臟中T 、B細(xì)胞缺失。

取Rag1-KO和Rag2-KO小鼠小鼠的脾臟細(xì)胞，通過(guò)FACS對(duì)其中T 、B和NK細(xì)胞的組成進(jìn)行分析（A）并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)對(duì)比（B）。

圖5. Rag1-KO和Rag2-KO小鼠胸腺中T 、B細(xì)胞缺失。

取Rag1-KO和Rag2-KO小鼠小鼠的胸腺細(xì)胞，通過(guò)FACS對(duì)其中T 、B和NK細(xì)胞的組成進(jìn)行分析（A）并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)對(duì)比（B）。

圖6. Rag2敲除小鼠胸腺和脾臟中EGFP檢測(cè)。

結(jié)果顯示Rag2 KO小鼠胸腺和脾臟中有EGFP陽(yáng)性的細(xì)胞，并且EGFP陽(yáng)性細(xì)胞均為CD4陰性和CD8陰性細(xì)胞。

Rag1、Rag2基因敲除小鼠的成瘤實(shí)驗(yàn)

圖7?不同背景小鼠接種A549腫瘤細(xì)胞成瘤性結(jié)果

將異源腫瘤細(xì)胞分別移植到Rag1-/-小鼠、Rag2-/-小鼠、NOD-SCID小鼠、BALB/c裸小鼠和野生型C57BL/6J小鼠上，觀察和比較腫瘤細(xì)胞移植后的生長(zhǎng)。

結(jié)果顯示，在Rag1-/-和Rag2-/-背景小鼠上，移植腫瘤生長(zhǎng)速度最快，且兩者之間無(wú)顯著性差異；在NOD-SCID背景小鼠上的腫瘤生長(zhǎng)速度次之；然后是在BALB/c裸小鼠背景；而在C57BL/6J小鼠上則無(wú)腫瘤生成(圖2A)。Rag1-/-和Rag2-/-小鼠上的腫瘤，自腫瘤移植22 d后，顯著大于BALB/c裸小鼠和NOD-SCID小鼠上的腫瘤體積(圖2A)。

腫瘤組織切片的HE染色結(jié)果顯示，來(lái)自Rag1-/-和Rag2-/-小鼠上的移植腫瘤組織和其他品系小鼠上的移植腫瘤組織切片沒(méi)有顯著差異，各組小鼠腫瘤細(xì)胞均生長(zhǎng)旺盛，腫瘤細(xì)胞大小不一，胞核形態(tài)比較類似，可見(jiàn)瘤組織均呈巢狀或片狀生長(zhǎng)，細(xì)胞間微血管較豐富(圖2B)。

Rag1-/-和Rag2-/-小鼠相較于傳統(tǒng)的異源腫瘤移植受體小鼠品系BALB/cNu裸小鼠和NOD-SCID小鼠，腫瘤生長(zhǎng)速度更快。