從名字就能知道這套系統(tǒng)的兩個(gè)主要組成部分：

Cre重組酶

環(huán)化重組酶（Cre, cyclization recombinase），是酪氨酸位點(diǎn)特異性重組酶之一，能催化兩個(gè)DNA識(shí)別位點(diǎn)之間的位點(diǎn)特異性重組。Cre重組酶來(lái)源于P1噬菌體，由 343個(gè)氨基酸組成，能特異性地識(shí)別Lox位點(diǎn)。除Cre以外，此類重組酶還有Flp（flipase）和Dre（D6特異性重組酶）。

Lox位點(diǎn)

Cre重組酶識(shí)別的回文DNA位點(diǎn)，也叫l(wèi)oxP (locus of X-over P1) 位點(diǎn)，長(zhǎng) 34bp，其特征結(jié)構(gòu)為ATAACTTCGTATA?-NNNTANNN-TATACGAAGTTAT。兩邊反向互補(bǔ)的13個(gè)堿基為Cre重組酶的識(shí)別序列，中間的8個(gè)堿基為重組發(fā)生位置，這也決定了loxP的方向。N表示可變堿基，不同的堿基選擇可形成不同的 Lox位點(diǎn)，除了野生型loxP，常見(jiàn)的還有 Lox2272，Lox511，Lox5171等等，這些突變Lox位點(diǎn)也能被Cre重組酶識(shí)別，但是只有兩個(gè)序列相同的Lox位點(diǎn)之間才能發(fā)生重組。

圖1 . loxP位點(diǎn)及其突變體位點(diǎn)。（圖片來(lái)自Ref.1）

在同一個(gè) DNA 分子上，根據(jù)Lox位點(diǎn)的位置與方向，可能會(huì)發(fā)生3種不同的重組事件：

（1）切除：當(dāng)兩個(gè)Lox位點(diǎn)在同一染色體上且方向相同時(shí)，將切除同向Lox位點(diǎn)之間的DNA序列（也叫Lox側(cè)翼序列，F(xiàn)lox序列）。

（2）反轉(zhuǎn)：當(dāng)兩個(gè)Lox位點(diǎn)位于同一染色體上且方向相反時(shí)，兩個(gè)Lox位點(diǎn)之間的序列發(fā)生序列反轉(zhuǎn)，即顛倒。

（3）易位：如果兩個(gè)Lox位點(diǎn)位于不同的染色體上且方向相同，則易位事件將導(dǎo)致DNA片段的交換。

圖2. Cre的重組機(jī)制。A）loxP位點(diǎn)的基本結(jié)構(gòu)。紅色箭頭指示loxP位點(diǎn)的方向。B）Cre-loxP介導(dǎo)的易位重組。C）左圖示Cre介導(dǎo)兩同向loxP位點(diǎn)間的切除重組。右圖示Cre介導(dǎo)兩反向loxP位點(diǎn)間的反轉(zhuǎn)重組。（圖片來(lái)自Ref.2）

利用Cre-lox系統(tǒng)在小鼠體內(nèi)實(shí)現(xiàn)對(duì)基因的時(shí)空特異性打靶（表達(dá)或敲除），原則上需要建立兩種小鼠。

首先，建立特異性Cre小鼠，該小鼠中的Cre重組酶由特定啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)，可在特定細(xì)胞或組織或全身表達(dá)Cre重組酶。Cre重組的特異性由驅(qū)動(dòng)Cre的啟動(dòng)子或增強(qiáng)子控制。

其次，需要建立Flox小鼠，即在該小鼠靶基因序列側(cè)翼帶有Lox位點(diǎn)。將上述兩種小鼠雜交繁育，子代中可以獲得既帶有Cre又帶有Flox基因的小鼠，即條件性基因打靶（表達(dá)或敲除靶基因）小鼠。

在小鼠中， Cre-lox系統(tǒng)最初被用于在特定細(xì)胞群中打開(kāi)基因的表達(dá)。條件性基因表達(dá)所需要的Flox小鼠，一般帶有一個(gè)沉默的轉(zhuǎn)基因，也就是說(shuō)在靶基因與啟動(dòng)子之間有一個(gè)“終止盒”（lox-stop-lox）。這個(gè)“終止盒”通常由強(qiáng)polyA信號(hào)和/或剪接供體序列構(gòu)成，能阻止轉(zhuǎn)基因的轉(zhuǎn)錄。這些Flox小鼠與細(xì)胞類型特異性表達(dá)Cre的轉(zhuǎn)基因小鼠交配后獲得的子代小鼠中，在每個(gè)表達(dá)Cre重組酶的細(xì)胞中，終止盒被Cre切除，因此僅在這些細(xì)胞中表達(dá)所需的轉(zhuǎn)基因。

圖3. 條件性基因表達(dá)小鼠原理示意圖。（圖片來(lái)自Ref.3）

條件性基因敲除所需要的Flox小鼠，一般在需要切除的DNA片段兩側(cè)帶有同方向的兩個(gè)Lox位點(diǎn)（lox-GENE-lox）。與細(xì)胞類型特異性Cre小鼠交配后，Cre 重組酶會(huì)識(shí)別Lox位點(diǎn)，導(dǎo)致靶基因被敲除。由于 Cre 基因的表達(dá)受上游啟動(dòng)子的調(diào)控，因此啟動(dòng)子的時(shí)空特異性就決定了基因重組的時(shí)空特異性。

圖4. 條件性基因敲除小鼠原理示意圖。（圖片來(lái)自Ref.3）

為了能夠更準(zhǔn)確地進(jìn)行遺傳功能研究，時(shí)間特異性的Cre-lox（也叫誘導(dǎo)型Cre-lox）被開(kāi)發(fā)出來(lái)，可用于研究生物體發(fā)育過(guò)程特定階段的基因功能，或用來(lái)進(jìn)行譜系示蹤等。常用誘導(dǎo)型Cre-lox系統(tǒng)有：

也叫他莫昔芬（Tam）誘導(dǎo)的Cre系統(tǒng)。將Cre與雌激素受體ER融合，可通過(guò)他莫昔芬（Tam）誘導(dǎo)Cre的重組活性。在沒(méi)有他莫昔芬的情況下，CreER融合蛋白與熱休克蛋白90（HSP90）相互作用并存在于細(xì)胞質(zhì)中（圖5.1）。給予他莫昔芬藥物處理會(huì)破壞HSP90與CreER的相互作用（圖5.2）。ER與Tam的相互作用誘導(dǎo)Cre的核易位（圖5.3）。在細(xì)胞核中，CreER識(shí)別loxP位點(diǎn)（圖5.4）并使組織X中的基因Y失活（圖5.5）。CreERT2在體內(nèi)對(duì)藥物誘導(dǎo)的敏感性更高，因此一般優(yōu)選使用CreERT2。

圖5. 他莫昔芬（Tam）誘導(dǎo)的Cre系統(tǒng)。（圖5-7來(lái)自Ref.4）

四環(huán)素誘導(dǎo)系統(tǒng)，也叫強(qiáng)力霉素（Dox，四環(huán)素衍生物）誘導(dǎo)的Cre系統(tǒng)。該系統(tǒng)有兩種模式：Tet-on和Tet-off，分別是Dox依賴性Cre的激活和Dox依賴性Cre的失活。Tet系統(tǒng)包括以下元件：反向四環(huán)素控制反式激活因子（rtTA）；四環(huán)素控制反式激活因子（tTA）；四環(huán)素響應(yīng)元件（TRE），通常是19個(gè)核苷酸的四環(huán)素操縱子（tetO）序列的7個(gè)重復(fù)，調(diào)節(jié)Cre基因的表達(dá)。Dox通常在小鼠的飼料或飲水中進(jìn)行給藥。

Cre;Tet-on系統(tǒng)

在Tet-on系統(tǒng)中，表達(dá)普遍存在的或組織特異性的啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的rtTA。在沒(méi)有Dox的情況下，失活的rtTA無(wú)法與負(fù)責(zé)調(diào)控Cre基因的TRE序列結(jié)合，則Cre不表達(dá)。在Dox給藥之后，Dox結(jié)合并激活rtTA。激活的rtTA與TRE序列結(jié)合并誘導(dǎo)Cre表達(dá)。

圖6. Dox誘導(dǎo)的Cre;Tet-on系統(tǒng)。Dox給藥才能打開(kāi)Cre表達(dá)。

Cre;Tet-off系統(tǒng)

另一方面，在Tet-off系統(tǒng)中，在沒(méi)有Dox的情況下，激活的tTA能夠結(jié)合Cre前的TRE序列并誘導(dǎo)Cre表達(dá)。而在Dox給藥后，與Dox相互作用的tTA被滅活。滅活的rTA不再與TRE結(jié)合，因此Cre表達(dá)受到抑制。

圖7. ?Dox誘導(dǎo)的Cre;Tet-off系統(tǒng)。Dox給藥后關(guān)閉Cre表達(dá)。

早期Cre小鼠的建立主要通過(guò)隨機(jī)轉(zhuǎn)基因的方式，將外源特異性啟動(dòng)子連同Cre基因序列隨機(jī)地整合到小鼠基因組中。這些隨機(jī)轉(zhuǎn)基因方法雖然可以篩選到細(xì)胞特異性表達(dá)的Cre小鼠品系，但是由于Cre整合的隨機(jī)位點(diǎn)和基因拷貝數(shù)的不可控，Cre重組酶的表達(dá)很可能會(huì)受到染色體狀態(tài)的影響，如DNA甲基化導(dǎo)致Cre的沉默。

因此，更為可靠的方法是通過(guò)基因打靶（ES細(xì)胞同源重組或CRISPR/Cas9途徑）的方式將單拷貝的Cre基因定點(diǎn)整合到內(nèi)源基因座中，受內(nèi)源基因表達(dá)調(diào)控。

這樣一般有以下3種做法：

（1）Cre表達(dá)框直接插入到內(nèi)源基因起始密碼子前；

（2）Cre連接在2A自剪切序列之后，插入到內(nèi)源基因終止密碼子位置；

（3）Cre連接在內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)（IRES）之后，插入到內(nèi)源基因終止密碼子之后。

第一種做法（1）在表達(dá)Cre重組酶的同時(shí)會(huì)破壞內(nèi)源基因的表達(dá)。有些基因的雜合子和純合子表達(dá)基因量不同導(dǎo)致下游信號(hào)強(qiáng)度差異。第三種做法（3），IRES介導(dǎo)的翻譯通常會(huì)導(dǎo)致Cre的表達(dá)強(qiáng)度衰減。此外，應(yīng)盡可能避免破壞內(nèi)源基因3‘UTR，防止影響表達(dá)后修飾。因此，在建立新的Cre小鼠時(shí)，測(cè)試并記錄新Cre小鼠中Cre的表達(dá)模式是非常有必要的。

圖8. ?Cre表達(dá)框直接插入到內(nèi)源基因起始密碼子前，在表達(dá)Cre重組酶的同時(shí)會(huì)破壞內(nèi)源基因的表達(dá)。

圖9. 將Cre基因定點(diǎn)敲入到內(nèi)源基因的3‘端，建立共表達(dá)Cre小鼠。

通常我們會(huì)利用Reporter小鼠與Cre小鼠雜交來(lái)驗(yàn)證Cre的表達(dá)譜。Reporter小鼠一般是在Rosa26位點(diǎn)插入帶有l(wèi)ox-stop-lox終止盒以及報(bào)告基因（LSL-R）的一種工具小鼠，只有Cre酶介導(dǎo)重組切除終止盒后，才會(huì)有報(bào)告基因的表達(dá)。例如需要驗(yàn)證GeneX-Cre定點(diǎn)整合小鼠，可將Cre雜合子小鼠（GeneXCre/wt）與Reporter雜合子（Reporter?lox/wt）或純合子（Reporterlox/lox）小鼠交配，通過(guò)免疫組化、免疫熒光或原位雜交來(lái)判斷Cre陽(yáng)性的子代小鼠(GeneXCre/wt?; Reporter?lox/wt)報(bào)告基因是否在已知表達(dá)GeneX的細(xì)胞中表達(dá)，從而了解Cre的特異性表達(dá)是否與預(yù)期的一致。

圖10. 用Reporter小鼠驗(yàn)證Cre小鼠示意圖。（圖片來(lái)自Ref.6）

Cre重組酶的重組效率并不是100%的，也就是說(shuō)當(dāng)Cre小鼠與flox小鼠交配后，特定組織中只有部分細(xì)胞中發(fā)生重組，因此會(huì)產(chǎn)生嵌合模式。

lox位點(diǎn)的放置位置會(huì)影響重組效率。只有兩個(gè)lox位點(diǎn)相遇才能在Cre作用下發(fā)生位點(diǎn)特異性重組，而兩個(gè)lox位點(diǎn)相距越遠(yuǎn)，它們相遇的概率就越低，導(dǎo)致重組效率也就越低。因此，在設(shè)計(jì)條件性基因打靶策略時(shí)，需要考慮基因結(jié)構(gòu)與flox區(qū)域的長(zhǎng)度，來(lái)降低重組失敗的風(fēng)險(xiǎn)。

Cre的表達(dá)量并不等同于Cre對(duì)lox位點(diǎn)的重組效率。很多時(shí)候由于基因組調(diào)控的復(fù)雜性，以及每個(gè)基因在不同細(xì)胞內(nèi)染色質(zhì)狀態(tài)不同，Cre對(duì)于不同基因位點(diǎn)的Loxp切割效率并不一致。甚至有可能會(huì)出現(xiàn)同一種Cre小鼠對(duì)一種flox基因起作用，對(duì)另一種flox基因則不起作用的極端情況。而在使用Reporter小鼠指示Cre活性時(shí)，由于Reporter小鼠中l(wèi)ox位點(diǎn)與報(bào)告基因所在的基因組狀態(tài)偏開(kāi)放，從而使得Cre在Reporter小鼠中重組的效率會(huì)比對(duì)實(shí)際目標(biāo)lox位點(diǎn)的重組效率要高一些。因此，Reporter小鼠驗(yàn)證的結(jié)果可以作為一種參考，但不是金標(biāo)準(zhǔn)。可以用多種不同的Reporter小鼠來(lái)檢測(cè)Cre小鼠的特異性重組,反映出Cre重組酶對(duì)不同基因的重組效率可能是不同的。

使用細(xì)胞特異性啟動(dòng)子控制Cre的表達(dá)可實(shí)現(xiàn)目標(biāo)基因的選擇性失活、激活或突變。通常我們希望Cre重組酶受啟動(dòng)子限制，僅在小鼠的部分細(xì)胞中發(fā)揮重組作用。但Cre的意外表達(dá)，或被稱為“異位”表達(dá)仍時(shí)常發(fā)生，這些異位表達(dá)可能會(huì)導(dǎo)致一些我們不希望發(fā)生的重組。因此在建立Cre小鼠時(shí)選擇譜系標(biāo)志基因很重要。高特異性的譜系標(biāo)志基因能高效精確地表達(dá)Cre，降低Cre漏表達(dá)或異位表達(dá)的概率。應(yīng)盡量避免使用那些高表達(dá)但非特異的標(biāo)志基因來(lái)構(gòu)建Cre小鼠。

在使用Reporter小鼠驗(yàn)證組織特異性GeneX-Cre小鼠時(shí)，由于對(duì)GeneX本身表達(dá)譜的研究并不詳盡，GeneX可能在生殖細(xì)胞或早期胚胎發(fā)育過(guò)程中存在瞬時(shí)表達(dá)，因此常常會(huì)發(fā)現(xiàn)報(bào)告基因的表達(dá)比預(yù)期的更為廣泛。想要明確是否發(fā)生了生殖系中的Cre意外表達(dá)，可以通過(guò)將不同性別的子代小鼠(GeneXCre/wt;Reporterlox/wt)分別與野生型小鼠交配獲得第二代。如果這些二代小鼠中報(bào)告基因的表達(dá)較第一代子代更為廣泛，那么很有可能發(fā)生了Cre的生殖系表達(dá)。因?yàn)镃re介導(dǎo)的重組可能發(fā)生在配子形成的二倍體階段，發(fā)生重組后的單倍體子細(xì)胞發(fā)育成胚胎，導(dǎo)致第二代子代小鼠即使沒(méi)有Cre基因的整合，仍表達(dá)報(bào)告基因。

如果Cre小鼠發(fā)生了生殖系表達(dá)，那么在應(yīng)用該Cre小鼠進(jìn)行條件性基因打靶時(shí)，需要謹(jǐn)慎選擇Cre小鼠的性別與交配方式以及對(duì)照組。比如，母系遺傳的Cre小鼠品系，需要使用雄性帶有Cre整合的小鼠進(jìn)行繁殖；而父系遺傳的Cre品系，則需要用雌性Cre陽(yáng)性小鼠來(lái)繁育。當(dāng)然，也可以通過(guò)使用誘導(dǎo)型Cre小鼠解決Cre生殖系意外表達(dá)的問(wèn)題，實(shí)現(xiàn)僅在成年或胚胎發(fā)育晚期激活Cre重組活性，獲得條件性基因打靶小鼠。

要獲得條件性基因敲除小鼠至少需要兩步遺傳雜交。第一步，將GeneX-Cre雜合子小鼠與GeneY-flox雜合或純合子小鼠交配，獲得的Cre與flox雙陽(yáng)性（GeneX?Cre/wt; GeneY?lox/wt）子代小鼠。第二步，將Cre與flox雙陽(yáng)性（GeneX?Cre/wt;GeneY?lox/wt）子代小鼠再與GeneY-flox雜合或純合子小鼠交配，獲得所需的GeneX?Cre/wt; GeneY?lox/lox小鼠為實(shí)驗(yàn)組。一般對(duì)照組為同窩GeneXwt/wt; GeneY?lox/lox小鼠。如果Cre的整合破壞內(nèi)源基因，那么應(yīng)選擇GeneX?Cre/wt;GeneY?wt/wt小鼠作為對(duì)照。

圖11. 條件性基因敲除的常規(guī)育種策略。

在進(jìn)行基因型鑒定的時(shí)候，不僅要對(duì)小鼠鼠尾進(jìn)行基因鑒定，對(duì)特異性目標(biāo)組織也需要進(jìn)行基因型檢測(cè)。這時(shí)需要設(shè)計(jì)PCR引物方便區(qū)分野生型等位基因、flox等位基因和重組后的KO等位基因。在鼠尾鑒定時(shí)，如果發(fā)現(xiàn)重組后的KO產(chǎn)物，那么需要考慮該組織特異性Cre小鼠的生殖系表達(dá)問(wèn)題。

圖12. 條件性基因敲除的基因型鑒定引物設(shè)計(jì)示意圖。

之后需要檢測(cè)重組后靶基因的mRNA和蛋白表達(dá)，來(lái)驗(yàn)證Cre-lox系統(tǒng)的工作效果。根據(jù)靶基因與lox位點(diǎn)的位置，可以設(shè)計(jì)qPCR模板或者探針來(lái)檢測(cè)重組后的靶基因轉(zhuǎn)錄情況。進(jìn)一步可以通過(guò)免疫組化檢測(cè)條件性基因敲除后靶基因蛋白翻譯是否缺失或異常。不過(guò)這很大程度上依賴于探針或抗體的靈敏度和特異性。

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