ES細(xì)胞打靶和CRISPR/Cas9 的技術(shù)特點(diǎn)

ES細(xì)胞打靶技術(shù)的核心就是對ES細(xì)胞的打靶操作。從同源重組載體的構(gòu)建、到ES細(xì)胞的打靶及陽性克隆篩選、再到ES細(xì)胞的囊胚注射獲得嵌合小鼠，這個(gè)過程大約需要4-6個(gè)月時(shí)間。而CRISPR/Cas9技術(shù)拋開了這部分工作，直接移植注射后的小鼠受精卵獲得F0代，大約只需要1個(gè)月左右，研發(fā)費(fèi)用也就節(jié)省了不少。

另一方面，通過ES細(xì)胞打靶技術(shù)獲得的基因修飾小鼠，其遺傳背景來自于我們選擇的ES細(xì)胞，而成熟的、可用于基因打靶的ES細(xì)胞系通常只有有限的幾種品系來源：C57BL/6N、C57BL/6J、129S3以及C57與129的雜交F1系。如果需要其它背景，則需要通過與目的品系野生型小鼠回交的方式獲得，回交代數(shù)在10代以上。而CRISPR/Cas9技術(shù)打破了小鼠品系的限制，可以實(shí)現(xiàn)在不同品系、甚至免疫缺陷品系上的遺傳修飾，比如：BALB/c、FVB、Nod、Nod-scid等等。

CRISRP/Cas9技術(shù)是短片段RNA介導(dǎo)的靶向基因修飾。脫靶一直是該技術(shù)應(yīng)用過程中很讓人糾結(jié)的問題。隨著這項(xiàng)技術(shù)的不斷發(fā)展與優(yōu)化，改良后的Cas9蛋白在精確性上的性能已大大改善。當(dāng)然，目前我們?nèi)詿o法阻止脫靶的發(fā)生，但有一些方法可以一定程度上減少脫靶的可能或排除脫靶帶來的影響。比如：

• 在設(shè)計(jì)guideRNA時(shí)，可以利用脫靶預(yù)測的公共資源來篩選高特異性guideRNA；
  

• 在獲得基因敲除小鼠模型后，可以通過與野生型小鼠交配，不斷地稀釋脫靶效應(yīng)；

• 或針對軟件預(yù)測的潛在脫靶位點(diǎn)進(jìn)行測序分析驗(yàn)證；

• 還可以針對同一種基因敲除小鼠模型設(shè)計(jì)不同靶點(diǎn)的guideRNA，獲得多個(gè)line，若表型相一致，那么可以推論該表型由指定基因敲除造成，而非脫靶效應(yīng)。

下面歸納比較一下這兩種技術(shù)吧：

那么，針對不同類型的基因修飾小鼠模型，我們又該如何選擇呢？

最后，技術(shù)策略并沒有絕對的好與劣。適合的才是最好的！