近期，國科大杭州高等研究院周斌教授團隊合作研究成果“Intercellular genetic tracing by alternative synthetic Notch signaling”在國際學術(shù)期刊Cell Discovery上發(fā)表。

該研究結(jié)合了合成生物學和遺傳學技術(shù)，開發(fā)了一種新的體內(nèi)鄰近細胞遺傳標記技術(shù)。研究發(fā)現(xiàn)在胚胎發(fā)育和器官形成過程中，不同細胞類型之間存在細胞通訊。這一發(fā)現(xiàn)不僅為理解早期器官發(fā)育提供了科學依據(jù)，也為臨床早期發(fā)育異常疾病的診斷和治療奠定了基礎(chǔ)，同時為體內(nèi)鄰近細胞研究提供了關(guān)鍵的技術(shù)支撐。

南模生物為該研究提供了R26-L-mCD19,R26-R-mCD19, Pdgfra-mCherry,?Cdh5-αmCh2NtTA-BFP和Cdh5-αmCh4NtTA-BFP小鼠。

近期，周斌團隊基于 Notch 信號通路工作原理，在體內(nèi)構(gòu)建人工合成的 Notch 信號通路，稱為 Synthetic Notch（synNotch），利用 synNotch 首次在哺乳動物體內(nèi)創(chuàng)建了鄰近細胞遺傳示蹤技術(shù)(genetic tracing of cell-cell contact，gTCCC)。

拓展：該技術(shù)是將Notch配體的胞外段替換為synNotch配體mGFP；將Notch受體的胞外段替換為synNotch受體anti-GFP，而胞內(nèi)段替換為tTA，跨膜域保持不變；再結(jié)合tetO-on與Cre-loxP系統(tǒng)，當表達synNotch受體的細胞與表達 synNotch配體的細胞發(fā)生接觸時，就可以實現(xiàn)對受體細胞進行遺傳標記及操作（Science，2022；Dev Cell，2023）。

在本研究中，研究人員開發(fā)了多種基于synNotch 技術(shù)的鄰近細胞標記新技術(shù)。他們首先根據(jù)mCD19和 anti-CD19構(gòu)建用于鄰近細胞標記的synNotch技術(shù)，簡稱gTCCC2。之后，研究人員構(gòu)建了兩種誘導型 mCD19配體工具小鼠：Rosa26-loxP-Stop-loxP-mCD19?(R26-L-mCD19)和Rosa26-rox-Stop-rox-mCD19?(R26-R-mCD19)，以及一種anti-CD19內(nèi)皮細胞受體工具小鼠：Cdh5-aCD19NtTA-tdT。

Fig 1. Generation of intercellular genetic systems based on CD19 for tracing cell?cell contact in vivo.?

在Tnni3-Dre;R26-R-mCD19;Cdh5-aCD19NtTA-tdT;tet-Cre四基因型小鼠中檢測心肌細胞是否與內(nèi)皮細胞發(fā)生直接接觸。心肌細胞表達mCD19，與內(nèi)皮細胞接觸時mCD19會識別內(nèi)皮細胞膜表面的anti-mCD19，從而釋放tTA入核啟動tet-Cre表達從而介導Cre-loxP重組，將內(nèi)皮細胞標記為 tdT⁺。同時通過對新生小鼠進行鑒定，研究人員成功檢測到心臟內(nèi)皮細胞被高效率標記，說明gTCCC2 技術(shù)構(gòu)建成功。

研究人員利用mCherry 和anti-mCherry構(gòu)建第三種鄰近細胞標記技術(shù)gTCCC3。免疫熒光染色結(jié)果顯示，成纖維細胞與內(nèi)皮細胞鄰近分布。為驗證這兩種細胞類型是否發(fā)生細胞接觸交流，研究人員構(gòu)建了成纖維細胞表達synNotch配體mCherry的工具小鼠： Pdgfra-mCherry，同時構(gòu)建了兩種表達anti-mCherry的內(nèi)皮細胞工具小鼠，Cdh5-amCh2NtTA-BFP 和Cdh5-amCh4NtTA-BFP。

Fig 2. Generation of intercellular genetic systems based on mCherry for tracing cell?cell contact in vivo.

在Pdgfra-mCherry;Cdh5-amChNtTA-BFP;tet-Cre小鼠中，若當內(nèi)皮細胞與成纖維細胞發(fā)生接觸，內(nèi)皮細胞則會被標記為BFP⁺。通過體內(nèi)驗證，研究人員檢測到新生小鼠多種器官中內(nèi)皮細胞被標記，這說明在胚胎發(fā)育中，成纖維細胞與內(nèi)皮細胞會發(fā)生直接接觸從而參與器官生成。

同時，研究人員也在體內(nèi)成功驗證了gTCCC，gTCCC2，gTCCC3 這三種鄰近標記技術(shù)不會發(fā)生交叉識別，可以正交使用。

綜上，研究團隊利用synNotch成功開發(fā)了兩種新的體內(nèi)細胞鄰近遺傳操作技術(shù)。這些技術(shù)結(jié)合Cre-loxP系統(tǒng)，能夠?qū)崿F(xiàn)對接觸細胞的特異性遺傳學操作。這三種gTCCC技術(shù)為研究體內(nèi)復雜的細胞間交流提供了關(guān)鍵的遺傳學工具。