2018年2月16日，Cancer Cell 發(fā)表了軍事醫(yī)學(xué)研究院生物工程研究所葉棋濃課題組的最新科研成果“Transcriptional Regulation of the Warburg Effect in Cancer by SIX1”，首次將miR-548a-3p/SIX1軸與Warburg效應(yīng)和腫瘤生長聯(lián)系起來，并闡明了相關(guān)作用機(jī)制。

此項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)：

• SIX1是新的Warburg 效應(yīng)的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子

• SIX1通過 HBO1和AIB1 增強(qiáng) Warburg 效應(yīng)

• SIX1糖酵解功能直接被 microRNA548a-3p 抑制

• miR-548a-3p / Six1軸調(diào)節(jié) Warburg 效應(yīng)和腫瘤生長

研究背景

1956年，德國生理學(xué)家Warburg發(fā)現(xiàn)了腫瘤細(xì)胞的一種異常代謝。正常細(xì)胞中，葡萄糖會(huì)維持一個(gè)平衡狀態(tài)，在缺氧狀態(tài)時(shí)，葡萄糖會(huì)轉(zhuǎn)變?yōu)楸徇M(jìn)而轉(zhuǎn)變?yōu)槿樗?，?dāng)氧含量正常時(shí)，丙酮酸會(huì)進(jìn)入線粒體，參與三羧酸循環(huán)并產(chǎn)生大量能量。而在癌細(xì)胞或其他高度增殖的細(xì)胞類型中，即使在常氧環(huán)境下，也不利用線粒體氧化磷酸化產(chǎn)能，而是利用有氧糖酵解，在胞質(zhì)中酵解形成大量乳酸，這就是“Warburg效應(yīng)”。

圖1. Myc和HIF-1調(diào)節(jié)葡萄糖代謝并刺激Warburg效應(yīng) （圖片來自Clin Cancer Res. 2009 Nov 1; 15(21): 6479–6483）。

以有氧糖酵解的形式在腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中起著重要作用，通過這種異常能量代謝，腫瘤細(xì)胞可以逃避正常的細(xì)胞凋亡程序，進(jìn)行增殖和遷徙，因此Warburg效應(yīng)是癌癥的一個(gè)重要標(biāo)志，人們正在致力于研發(fā)針對(duì)Warburg效應(yīng)的抗腫瘤藥物。

已經(jīng)發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)錄因子HIF-1a和c-Myc是Warburg效應(yīng)的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子。Myc和HIF-1調(diào)節(jié)（上圖虛線表示）參與葡萄糖代謝的基因（葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白Glut1，HK2，PKM2，LDHA和PDK1），有利于葡萄糖轉(zhuǎn)化為乳酸（糖酵解）。Myc也通過調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（SLC1A5）和谷氨酰胺酶（GLS）來刺激谷氨酰胺代謝。谷氨酰胺通過脫氨基作用變成α-酮戊二酸（α-KG），從而進(jìn)入三羧酸循環(huán)，分解代謝成蘋果酸，被轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞質(zhì)并轉(zhuǎn)化為丙酮酸，然后轉(zhuǎn)化為乳酸鹽（谷氨酰胺分解）。 PDH，丙酮酸脫氫酶。

不過，目前只有為數(shù)不多的幾個(gè)轉(zhuǎn)錄因子被報(bào)道參與了Warburg效應(yīng)的調(diào)控，因此，人們對(duì)Warburg效應(yīng)的轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制仍知之甚少。

研究成果

• SIX1是Warburg效應(yīng)的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子

對(duì)SIX1穩(wěn)定敲低（KD）的乳腺癌細(xì)胞系ZR75-1及對(duì)照細(xì)胞系進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序（RNA-seq）分析以及Realtime RT-PCR驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)SIX1敲低后一系列糖酵解通路相關(guān)基因的表達(dá)發(fā)生了改變；類似的，SIX1敲除（KO）乳腺癌細(xì)胞系ZR75-1和SIX1 KD肝癌細(xì)胞系HepG2中糖酵解關(guān)鍵基因（GLUT1、HK2、PFKL、ALDOA、GAPDH、PGK1、ENO1、PKM2、LDHA）均顯著下調(diào)；重新表達(dá)SIX1可以拯救這些變化。同樣，在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中，Six1 KO小鼠的成纖維細(xì)胞（MEFs）、胚胎、肝臟、小腸、肺組織中也檢測(cè)到相似結(jié)果（圖2）。提示了SIX1是調(diào)節(jié)糖酵解基因表達(dá)的關(guān)鍵因子。

圖2. Six1 KO小鼠胚胎及相關(guān)組織中糖酵解基因表達(dá)變化

• SIX1通過結(jié)合SIX1響應(yīng)元件促進(jìn)糖酵解基因表達(dá)

早前研究提示SIX1的DNA結(jié)合位點(diǎn)具有TCAG/TG特征序列，而且SIX1直接與6個(gè)糖酵解基因（PFKL, ALDOA, PGK1, ENO1, PKM2和LDHA）的啟動(dòng)子結(jié)合。因此，為研究SIX1如何調(diào)控糖酵解基因的轉(zhuǎn)錄，利用熒光素酶報(bào)告基因系統(tǒng)，將受調(diào)控的糖酵解基因啟動(dòng)子區(qū)域約3 kb的范圍內(nèi)含有SIX1結(jié)合位點(diǎn)的序列作為啟動(dòng)子，觀察SIX1是否激活熒光素酶的表達(dá)（圖3A）。利用染色質(zhì)免疫共沉淀（ChIP）也進(jìn)一步證實(shí)了SIX1調(diào)控糖酵解基因的轉(zhuǎn)錄是通過結(jié)合于它們的啟動(dòng)子來實(shí)現(xiàn)的（圖3B）。

圖3. SIX1通過結(jié)合于帶有SIX1響應(yīng)元件的啟動(dòng)子來促進(jìn)糖酵解基因表達(dá)

• SIX1促進(jìn)糖酵解基因轉(zhuǎn)錄主要是通過HBO1和AIB1介導(dǎo)的組蛋白乙酰化

基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控需要轉(zhuǎn)錄因子與組蛋白修飾酶的相互作用，而組蛋白乙?；ǔＥc轉(zhuǎn)錄激活相關(guān)。利用免疫共沉淀（CoIP）結(jié)合質(zhì)譜法，篩選出兩個(gè)與SIX1相互作用的組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶——HBO1與AIB1。利用HBO1和AIB1 KO、KD細(xì)胞系發(fā)現(xiàn)，HBO1 KO或KD細(xì)胞系中HK2, ALDOA, PGK1, ENO1 和 LDHA基因表達(dá)下調(diào)；AIB1 KO或KD細(xì)胞系中GLUT1, PFKL, ENO1, PKM2, 和 LDHA表達(dá)下調(diào)。重要的是，HBO1/AIB1 KO 或 KD后，SIX1對(duì)糖酵解基因的激活能力顯著降低或消失了。說明SIX1調(diào)控糖酵解基因的表達(dá)需通過與HBO1和AIB1的相互作用實(shí)現(xiàn)（圖4A-D）。

那么SIX1是如何通過HBO1和AIB1調(diào)控糖酵解基因的呢。通過ChIP實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，SIX1促進(jìn)糖酵解基因的轉(zhuǎn)錄是通過HBO1介導(dǎo)的H4K5乙酰化和AIB1介導(dǎo)的H3K4乙?；瘜?shí)現(xiàn)的（圖4H）。

圖4. SIX1促進(jìn)糖酵解基因轉(zhuǎn)錄主要是通過HBO1和AIB1介導(dǎo)的組蛋白乙酰化

• SIX1被miR-548a-3p抑制，從而下調(diào)糖酵解基因表達(dá)

接下來要尋找上游調(diào)控SIX1的microRNAs。通過靶點(diǎn)預(yù)測(cè)，篩選到若干潛在的SIX1靶向miRNAs，其中只有miR-548a-3p能夠直接特異地抑制SIX1蛋白表達(dá)，并且降低受SIX1調(diào)控的糖酵解基因的表達(dá)。如果敲除SIX1基因，則miR-548a-3p對(duì)糖酵解基因的抑制作用也隨之消失。說明miR-548a-3p通過SIX抑制糖酵解基因的表達(dá)（圖5）。

圖5. miR-548a-3p通過SIX抑制糖酵解基因的表達(dá)

• 體外實(shí)驗(yàn)表明miR-548a-3p/SIX1軸調(diào)節(jié)有氧糖酵解，影響腫瘤細(xì)胞擴(kuò)增

miR-548a-3p mimics降低了腫瘤細(xì)胞的葡萄糖攝取、丙酮酸、乳酸及ATP水平、細(xì)胞外酸化率（ECAR）以及細(xì)胞有氧呼吸消耗速率（OCR）。SIX1敲除后，細(xì)胞的這些糖酵解表型變化消失，說明miR-548a-3p通過SIX1基因行使抑制糖酵解表型的功能。HBO1/AIB1 KO或KD后，SIX1對(duì)這些糖酵解表型的調(diào)節(jié)功能受到嚴(yán)重影響，說明SIX1需要依靠HBO1和AIB1來發(fā)揮調(diào)節(jié)作用。（圖6A-L）

miR-548a-3p mimics抑制了腫瘤細(xì)胞的增殖。糖酵解抑制劑（2-DG和3-BP）抑制了腫瘤細(xì)胞的增殖，降低了anti-miR-548a-3p 和 SIX1 對(duì)腫瘤細(xì)胞增殖的促進(jìn)作用。（圖6M-O）

圖6. 體外實(shí)驗(yàn)表明miR-548a-3p/SIX1軸調(diào)節(jié)有氧糖酵解，影響腫瘤細(xì)胞擴(kuò)增

• miR-548a-3p/SIX1軸在體內(nèi)同樣調(diào)控有氧糖酵解及腫瘤細(xì)胞擴(kuò)增

在裸鼠異種移植瘤模型中，利用18FDG標(biāo)記的小動(dòng)物PET技術(shù)檢測(cè)腫瘤的糖攝取能力，發(fā)現(xiàn)miR-548a-3p通過SIX1調(diào)節(jié)糖攝取，而SIX1通過HBO1和AIB1發(fā)揮作用（圖7A-E）。通過糖酵解抑制劑2-DG或敲低LDHA糖酵解酶抑制糖酵解過程后，腫瘤生長和乳酸水平都顯著受到抑制。更重要的是，糖酵解抑制劑2-DG或敲低LDHA糖酵解酶消除了anti-miR-548a-3p和SIX1對(duì)腫瘤生長及乳酸水平的刺激作用，說明miR-548a-3p/SIX1軸介導(dǎo)的糖酵解對(duì)于腫瘤細(xì)胞的生長非常關(guān)鍵（圖7F-I）。

在Six1基因敲除小鼠胚胎中糖攝取及乳酸水平均顯著下降（圖7J）。而糖攝取增加的乳腺癌患者腫瘤樣本中的miR-548a-3p表達(dá)下調(diào)，SIX1表達(dá)上調(diào)（圖7K）。

圖7. miR-548a-3p/SIX1軸在體內(nèi)同樣調(diào)控有氧糖酵解及腫瘤細(xì)胞擴(kuò)增

• 臨床腫瘤相關(guān)SIX1基因突變會(huì)促進(jìn)糖酵解基因表達(dá)、有氧糖酵解以及腫瘤生長

臨床研究發(fā)現(xiàn)，在腫瘤中存在SIX1基因的Q177R突變。為研究該突變與糖酵解基因表達(dá)的關(guān)系，在SIX1基因敲除的腫瘤細(xì)胞系以及Six1基因敲除小鼠的MEF細(xì)胞中檢測(cè)糖酵解基因的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)相關(guān)糖酵解基因（HK2, GAPDH, PKM2 和 LDHA)表達(dá)上調(diào)。利用ChIP實(shí)驗(yàn)證明SIX1（Q177R）突變后，其被招募到HK2和LDHA基因啟動(dòng)子上的信號(hào)較野生型SIX1更強(qiáng)，對(duì)啟動(dòng)子的激活能力更強(qiáng)。（圖8A-E）

SIX1（Q177R）突變體在體外實(shí)驗(yàn)中增加了糖攝取、丙酮酸水平、乳酸產(chǎn)生以及ATP水平。SIX1敲除的腫瘤細(xì)胞在導(dǎo)入SIX1（Q177R）突變體后，與導(dǎo)入野生型SIX1相比，生長更為旺盛。SIX1（Q177R）突變后，HK2和LDHA的表達(dá)水平也更高。（圖8F-J）

圖8. 臨床腫瘤相關(guān)SIX1基因Q177R突變會(huì)促進(jìn)糖酵解基因表達(dá)、有氧糖酵解以及腫瘤生長

• miR-548a-3p/SIX1軸在乳腺癌中的臨床相關(guān)性

對(duì)乳腺癌患者標(biāo)本進(jìn)行檢測(cè)以及數(shù)據(jù)庫分析發(fā)現(xiàn)，miR-548a-3p表達(dá)與SIX1基因表達(dá)負(fù)相關(guān)、與PGK1、LDHA等糖酵解基因也成負(fù)相關(guān)，SIX1與糖酵解基因表達(dá)成正相關(guān)（圖9A）。SIX1被發(fā)現(xiàn)在多種腫瘤中有過表達(dá)，比如：超過50%的乳腺癌患者、超過60%的肝癌患者中SIX1高表達(dá)。但是miR-548a-3p表達(dá)在臨床腫瘤中的情況尚不清楚。此研究發(fā)現(xiàn)乳腺癌腫瘤組織中miR-548a-3p是顯著下調(diào)的，與腫瘤體積、淋巴結(jié)狀態(tài)、腫瘤分級(jí)成負(fù)相關(guān)。另外，miR-548a-3p表達(dá)高的患者預(yù)后比較好。（圖9B-C）

圖9. miR-548a-3p/SIX1軸在乳腺癌中的臨床相關(guān)性

總結(jié)

SIX1是Warburg 效應(yīng)的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子。在缺氧條件下，miR-548a-3p表達(dá)被抑制，使下游靶基因SIX1活化，而SIX1通過與組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶HBO1和AIB1相互作用，激活一系列糖酵解基因表達(dá)，進(jìn)而影響調(diào)控細(xì)胞糖酵解過程，最終促進(jìn)細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化及癌癥發(fā)生。這一發(fā)現(xiàn)為新的抗腫瘤藥物研發(fā)提供了新的靶點(diǎn)與思路。

圖10. miR-548a-3p / SIX1 / HBO1 / AIB1軸在腫瘤生長中的作用模式圖

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