腫瘤壞死因子（TNF）超家族蛋白是一系列免疫細(xì)胞互相協(xié)調(diào)的關(guān)鍵蛋白。這個(gè)家族中的許多成員都成為了腫瘤免疫治療的標(biāo)靶。今天我們要說(shuō)的TNFR2也是其中之一。

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TNFR2的表達(dá)與結(jié)構(gòu)

TNFR2，也叫CD120b或者p75，全名為 Tumor necrosis factor receptor 2，是腫瘤壞死因子（TNF）受體超家族成員，能夠通過(guò)富含細(xì)胞半胱氨酸的結(jié)構(gòu)域結(jié)合腫瘤壞死因子（TNF）。

TNFR2是單程跨膜糖蛋白，由439個(gè)氨基酸組成，其中前235個(gè)氨基酸形成包含四個(gè)富含半胱氨酸基序的胞外結(jié)構(gòu)，30個(gè)氨基酸形成跨膜結(jié)構(gòu)域，后174個(gè)氨基酸形成具有TRAF2結(jié)合位點(diǎn)的胞內(nèi)結(jié)構(gòu)[1]。

TNFR2蛋白由TNFRSF1B基因編碼。人TNFRSF1B基因位于1號(hào)染色體1p36.22。小鼠同源基因Tnfrsf1b位于小鼠4號(hào)染色體。

TNFR2的表達(dá)僅限于抑制性免疫細(xì)胞，尤其是調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（Tregs），髓系抑制性細(xì)胞(MDSCs)，內(nèi)皮細(xì)胞和生長(zhǎng)過(guò)程中的選擇神經(jīng)元。此外，TNFR2也在腫瘤細(xì)胞中表達(dá)[2-4]。

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TNFR2/TNF信號(hào)

TNFR2是TNF的受體之一。TNF有兩種結(jié)構(gòu)相關(guān)但功能不同的受體，TNFR1（p55）和TNFR2（p75）。與TNFR1主要負(fù)責(zé)TNF介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡和死亡、誘發(fā)促炎反應(yīng)不同，TNFR2雖然也能與可溶性sTNF結(jié)合，但與跨膜mTNF親和力更高，且僅被mTNF完全激活并觸發(fā)有效的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，行使細(xì)胞存活和免疫抑制相關(guān)功能[5]。

在癌細(xì)胞和免疫抑制細(xì)胞中，當(dāng)mTNF與TNFR2結(jié)合激活信號(hào)時(shí)，TNFR2通過(guò)激活NFκB誘導(dǎo)激酶（NIK）誘導(dǎo)NFκB的非規(guī)范性激活，進(jìn)一步導(dǎo)致IKKα磷酸化和p100的加工，也是p52/RelB的核易位的關(guān)鍵步驟。TNFR2還招募TRAF2-cIAP1-cIAP2復(fù)合物。cIAP具有泛素連接酶活性，可以抑制caspases和其他凋亡誘導(dǎo)因子，從而激活規(guī)范性和非規(guī)范性NF-κB/Rel和MAPK信號(hào)通路。TNFR2信號(hào)分別通過(guò)RIPK1和Etk進(jìn)行信號(hào)傳導(dǎo)。RIPK1通過(guò)IkB激酶（IKK）復(fù)合物觸發(fā)NF-κB，這使IL-2的表達(dá)被激活，以及與細(xì)胞存活和增殖正相關(guān)的幾個(gè)基因的轉(zhuǎn)錄增加。TNFR2介導(dǎo)的Etk磷酸化能部分激活VEGFR2，進(jìn)而激活了PI3K/Akt信號(hào)途徑，不僅維持細(xì)胞存活并增強(qiáng)增殖，還招募Etk形成參與細(xì)胞粘附、遷移、存活和增殖的TNFR2-Etk-VEGFR2復(fù)合物。此外，它還會(huì)增強(qiáng)STAT5的磷酸化，這對(duì)免疫抑制具有關(guān)鍵作用[2,6,7]。

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圖1?.?Signaling Pathways of TNFR （圖片來(lái)自Ref.1）

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TNFR2與Treg

Treg是一種典型的免疫抑制細(xì)胞，通過(guò)抑制效應(yīng)T細(xì)胞增殖和細(xì)胞因子生成，從而抑制過(guò)度的免疫反應(yīng)并維持免疫穩(wěn)態(tài)。與人類Treg一樣，小鼠胸腺CD4 +?CD25?+?Treg和外周CD4 +?CD25?+?Treg相對(duì)于CD4 +?CD25?–?Teff效應(yīng)細(xì)胞均具有高水平的TNFR2表達(dá)，而TNFR1幾乎檢測(cè)不到[7]。研究表明，TNF/TNFR2信號(hào)對(duì)于在炎性環(huán)境中維持FOXP3表達(dá)以及小鼠Treg的穩(wěn)定性至關(guān)重要。當(dāng)TNFR2信號(hào)被激活時(shí)，會(huì)增強(qiáng)Treg的穩(wěn)定性、對(duì)TCR刺激的響應(yīng)、擴(kuò)增以及功能。能促進(jìn)Treg和效應(yīng)T細(xì)胞產(chǎn)生IL-2，并提高Treg對(duì)IL-2的敏感性。 IL-2可以抑制Th17細(xì)胞分化以及TNFR2信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)對(duì)Treg的作用。 在炎性條件下，膜結(jié)合型受體mTNFR2可能脫落為可溶型受體sTNFR2，sTNFR2中和TNF并阻礙IL-6的表達(dá)[3]。

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圖2?.?TNFR2?信號(hào)激活的作用（圖片來(lái)自Ref.3）

TNFR2與自身免疫性疾病

Treg的功能缺陷以及數(shù)量低下是各種自身免疫性疾病的主要特征。因此，恢復(fù)適當(dāng)?shù)墓δ苄訲reg利于誘導(dǎo)免疫耐受已成為治療自身免疫性疾病的主要目標(biāo)。如上文所述，TNFR2激動(dòng)劑具有增強(qiáng)Treg增殖和活化的作用。在包括T1D、SLE、IBD和MS在內(nèi)的多種人自身免疫性疾病中都發(fā)現(xiàn)了TNF-TNFR信號(hào)通路的受損。如T1D患者的TNFR2+?Treg更高。 在使用TNFR2激動(dòng)型抗體治療T1D的研究中發(fā)現(xiàn)了TNFR2激動(dòng)劑可以殺死致病性自身反應(yīng)性CD8 T細(xì)胞，這表明誘導(dǎo)TNF-TNFR2途徑是選擇性殺死自身反應(yīng)性T細(xì)胞的有效方法[8]。

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圖3.?在自身免疫性疾病的組織部位，Treg細(xì)胞太少，Teff細(xì)胞或細(xì)胞毒性T細(xì)胞太多。TNFR2激動(dòng)劑可以改變這種異常的微環(huán)境并將其轉(zhuǎn)變?yōu)榉羌膊顟B(tài)。（圖片來(lái)自Ref.7）

TNFR2與腫瘤免疫治療

TNFR2除了維持Treg增殖和穩(wěn)定的作用以外，還起著癌基因的作用。目前已在至少25種腫瘤中確定了TNFR2的表達(dá)，如人類腎細(xì)胞癌、多發(fā)性骨髓瘤、結(jié)腸癌、卵巢癌、皮膚T細(xì)胞淋巴瘤（CTCL）等[4,7]。腫瘤微環(huán)境會(huì)狡猾地招募具有高免疫抑制力的TNFR2+?Treg細(xì)胞，從而促進(jìn)腫瘤免疫逃逸。轉(zhuǎn)移性黑素瘤患者中的Treg細(xì)胞TNFR2基因表達(dá)上升與CD8細(xì)胞毒性T細(xì)胞耗盡有關(guān)。TNFR2基因敲除小鼠對(duì)腫瘤表現(xiàn)出增強(qiáng)的免疫應(yīng)答，腫瘤生長(zhǎng)放緩。這可能是由于缺乏TNFR2+?Treg，或未能發(fā)展出全身性自身免疫，或MDSC數(shù)量減少和功能受損[4]。因此，利用TNFR2拮抗劑抑制Tregs，恢復(fù)腫瘤免疫應(yīng)答并消除腫瘤，成為了腫瘤免疫治療的又一策略。

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圖4. TNFR2?+?Treg在腫瘤免疫中的作用（圖片來(lái)自Ref.11）

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體外研究表明，TNFR2拮抗型抗體可以抑制卵巢癌細(xì)胞以及與腫瘤相關(guān)的Treg的增殖[9]；晚期Sézary綜合征中表達(dá)TNFR2的腫瘤細(xì)胞可以被TNFR2拮抗型抗體消除，同時(shí)TNFR2拮抗型抗體還殺死了TNFR2+?Treg，通過(guò)抑制Treg擴(kuò)增Teff將Treg/Teff比調(diào)節(jié)至正常水平[4]。

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圖5.?TNFR2拮抗型抗體阻斷TNF/TNFR2軸對(duì)腫瘤免疫治療的作用（圖片來(lái)自Ref.10）。（A）TNFR2在癌細(xì)胞和抑制性免疫細(xì)胞（包括Treg和MDSC）上表達(dá)。 TNF與TNFR2結(jié)合后通過(guò)Treg和MDSC的擴(kuò)增導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞的增殖和免疫逃逸，并抑制效應(yīng)Teff細(xì)胞的免疫應(yīng)答。 （B）通過(guò)TNFR2抗體對(duì)TNFR2的阻斷逆轉(zhuǎn)這種情況，促進(jìn)Teff對(duì)抗腫瘤細(xì)胞的免疫功能。

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圖6.?靶向TNFR2的納米顆粒對(duì)腫瘤細(xì)胞以及Treg的作用模型（圖片來(lái)自Ref.6）。通過(guò)基于特定配體可靶向腫瘤細(xì)胞的納米粒子將TNFR2抗體運(yùn)輸?shù)侥[瘤微環(huán)境中釋放，從而阻斷腫瘤細(xì)胞和Tregs上的TNFR2，抑制Tregs并激活Teff，最終達(dá)到減少腫瘤發(fā)生、侵襲和轉(zhuǎn)移的治療目的。

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TNFR2人源化小鼠模型（TNFRSF1B-HU）的建立、驗(yàn)證與應(yīng)用

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品系全名	C57BL/6J-Tnfrsf1bem2(hTNFRSF1B)Smoc
目錄號(hào)	NM-HU-190010
基因名	Tnfrsf1b
品系描述	利用CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)，南模生物自主研發(fā)TNFR2人源化小鼠模型，將小鼠Tnfrsf1b基因替換為人源TNFRSF1B基因，從而表達(dá)人TNFR2蛋白，取代小鼠內(nèi)源Tnfr2蛋白的表達(dá)。

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TNFR2人源化小鼠模型（TNFRSF1B-HU）的表達(dá)驗(yàn)證

雜合子和純合子TNFR2人源化小鼠模型（TNFRSF1B-HU）脾臟Treg細(xì)胞和中性粒細(xì)胞中均可檢測(cè)到hTNFR2的活躍表達(dá)。

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圖7. FACS檢測(cè)TNFR2人源化小鼠模型（TNFRSF1B-HU）脾臟細(xì)胞人源hTNFR2的表達(dá)。

雜合子和純合子TNFR2人源化小鼠模型（TNFRSF1B-HU）外周血Treg細(xì)胞和中性粒細(xì)胞中均可檢測(cè)到hTNFR2的活躍表達(dá)。

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圖8.??FACS檢測(cè)TNFR2人源化小鼠模型（TNFRSF1B-HU）外周血細(xì)胞中人源hTNFR2的表達(dá)。

雜合子TNFR2人源化小鼠模型（TNFRSF1B-HU）淋巴結(jié)細(xì)胞中可檢測(cè)到hTNFR2的活躍表達(dá)。

圖9.?FACS 檢測(cè)TNFR2人源化小鼠模型（TNFRSF1B-HU）淋巴結(jié)細(xì)胞人源TNFRSF1B的表達(dá)。

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TNFR2人源化小鼠模型（TNFRSF1B-HU）在藥效評(píng)價(jià)中的應(yīng)用

TNFR2人源化小鼠（TNFRSF1B-HU）MC38-OVA荷瘤模型中，兩種anti-hTNFR2抗體均表現(xiàn)出顯著的抗腫瘤療效。

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圖10.?In vivo efficacy evaluation of anti-hTNFR2 in TNFR2 humanized?mice (TNFRSF1B-HU) with MC38-OVA tumors

FACS分析anti-hTNFR2抗體治療后TNFR2人源化小鼠（TNFRSF1B-HU）MC38-OVA荷瘤模型血液中各類淋巴細(xì)胞的比例。

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圖11.?FACS for blood upon TNFR2 antagonist treatment.

FACS分析anti-hTNFR2抗體治療后TNFR2人源化小鼠（TNFRSF1B-HU）MC38-OVA荷瘤模型腫瘤浸潤(rùn)淋巴細(xì)胞比例。

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圖12. TIL analysis upon TNFR2 antagonist treatment.?

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TNFR2拮抗劑可通過(guò)消除腫瘤微環(huán)境中的Treg并激活Teff來(lái)恢復(fù)T細(xì)胞平衡。

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圖13.?TNFR2 atagonists can restore the T cell balance by eliminating Treg and activating Teff in tumor microenvironment.

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References

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