基因敲除、條件性基因敲除、點(diǎn)突變、條件性點(diǎn)突變、基因敲入、點(diǎn)突變等等，各種類型的小鼠模型越來越多地被應(yīng)用到生物醫(yī)學(xué)研究中。同時(shí)，獲得新的基因修飾小鼠也變得越來越容易。這讓我們能夠組合出更多全新的小鼠模型，讓多種功能或多種遺傳改變能最終在同一只小鼠上實(shí)現(xiàn)。比如，在一個(gè)A基因點(diǎn)突變的小鼠上敲除B基因、同時(shí)還帶有另一種細(xì)胞示蹤的熒光標(biāo)記。

聽上去很酷！仔細(xì)想想，這意味著需要將3種甚至4種小鼠品系交配到一起。真的繁育起來可就不是那么簡(jiǎn)單了，很可能會(huì)弄得手忙腳亂。

因此，制定一份有效的繁育方案顯得尤為重要。怎么才能用最快的速度、最高的效率、最少的成本來獲得自己想要的新品系呢？今天，我們就來詳細(xì)分解。

基礎(chǔ)：孟德爾定律與旁氏表

旁氏表（Punnett square），也叫棋盤法，是用于預(yù)測(cè)特定雜交或育種實(shí)驗(yàn)結(jié)果的一種圖表，可以預(yù)測(cè)后代中擁有特定基因型的概率。

單基因雜交旁氏表示例，每個(gè)后代個(gè)體擁有基因型BB、Bb及bb的概率分別為25%、50%及25%。

雙基因旁氏表示例。

推薦使用樹形圖，因?yàn)闃湫螆D對(duì)于雙/多基因雜交的情況會(huì)更為直觀、方便。

第一步：確定基因型

確定繁育方案的第一步，也是最關(guān)鍵的一步，是確定實(shí)驗(yàn)和對(duì)照組所需要的小鼠基因型。無論是只有單基因突變或者轉(zhuǎn)基因，還是涉及到多個(gè)基因，都需要在開始繁殖之前清楚地明確自己的最終目標(biāo)。

“在目標(biāo)設(shè)定不明確時(shí)就匆忙開始進(jìn)行繁育”這是非常不正確的做法，卻又是很多同學(xué)容易犯的錯(cuò)誤。這會(huì)導(dǎo)致很多后續(xù)的問題，比如：產(chǎn)生所需小鼠的比例過低、沒有產(chǎn)生適合的對(duì)照小鼠等等。

今天，我們以常見的條件性基因敲除Cre-lox系統(tǒng)為例：

• 實(shí)驗(yàn)組小鼠：flox（帶有l(wèi)oxP位點(diǎn)的基因）純合子，以及Cre雜合子

• 對(duì)照組小鼠：flox（帶有l(wèi)oxP位點(diǎn)的基因）純合子，以及Cre陰性（野生型）

第二步：倒推法上溯繁育路線

確定了最終的小鼠基因型后，就可以倒推一代，找到一種最高效的終端交配方式，能夠最大程度同時(shí)獲得實(shí)驗(yàn)組與同窩對(duì)照組小鼠。

你可以這樣考慮：

1）找到實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組之間的共有目標(biāo)等位基因。如果可以的話，把這個(gè)共有目標(biāo)等位基因變成純合子。

2）分別對(duì)每個(gè)等位基因進(jìn)行雜交，然后把它們合并起來。

以常見的條件性基因敲除Cre-lox系統(tǒng)為例：

實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組都是flox（帶有l(wèi)oxP位點(diǎn)的基因）純合子，因此flox就是共有等位基因。由于兩組都需要flox純合子，因此最高效的方式是通過flox純合子來繁育flox純合子。對(duì)于Cre基因，我們需要Cre雜合子和不帶Cre（陰性）的野生型。如果通過Cre雜合子與野生型交配，那么預(yù)期產(chǎn)生50％雜合子和50％野生型。

也就是，

flox純合子? X? flox純合子

Cre 雜合子? X? Cre陰性野生型

如此，最高效的終端交配方式就是：

flox純合子；Cre 雜合子? X? flox純合子；Cre陰性野生型

這樣我們可以獲得50%實(shí)驗(yàn)組基因型小鼠和50%對(duì)照組基因型小鼠（這里沒有考慮小鼠性別）。

如果看過我們的繁育手冊(cè)的童靴們可能要問了，為什么手冊(cè)上沒有直接畫出這個(gè)高比例的方式呢？

原因是，這里flox純合子；Cre雜合子基因型的小鼠既是我們最終目標(biāo)的實(shí)驗(yàn)組，又是終端交配的親代。而flox的基因在Cre重組酶作用后被敲除，可能已經(jīng)產(chǎn)生了一些表型影響到生殖或發(fā)育，因此并不是每一種flox純合子；Cre雜合子都適合用于作為繁育的親代。

接下來繼續(xù)向上反溯親代的雜交方式，直到現(xiàn)有小鼠的基因型。通常來說，可以的話盡量獲得并使用純合子。這樣既能高比例的獲得帶有突變的子代，又能減少繁育中使用小鼠的數(shù)量。

再次以Cre-lox系統(tǒng)為例：

1）將flox純合子與Cre 雜合子雜交，可產(chǎn)生50% flox雜合子；Cre 雜合子。

2）將flox雜合子；Cre 雜合子與flox純合子雜交，可產(chǎn)生25% flox純合子；Cre 雜合子小鼠和25% flox純合子；Cre陰性小鼠。

細(xì)心的你可能又發(fā)現(xiàn)了，這個(gè)圖好像還是跟繁育手冊(cè)上的不太一樣嘛。為什么呢？

因?yàn)槠瘘c(diǎn)不同。這種最高效的繁育方式的起點(diǎn)是已經(jīng)獲得了足夠數(shù)量的flox純合子。flox純合子又是怎么獲得的呢？最初可以通過flox雜合子與flox雜合子交配，概率是25%。

所以，如果以flox雜合子作為繁育的起點(diǎn)，那么flox雜合子；Cre 雜合子也可以通過flox雜合子與Cre雜合子交配獲得，概率是25%。

我們?cè)夙樦垡晦圻@個(gè)過程，就可以大致得到下面的這張繁育路線圖：

當(dāng)然這并不是唯一的繁育路線。事實(shí)上，繁育路線的選擇還受到很多其它因素的影響，例如：

• 在涉及兩個(gè)以上基因的時(shí)候，要考慮到它們是否在不同的染色體上？如果在同一條染色體上，就可能會(huì)使繁育計(jì)劃受限。

• 如果某一種基因型由于突變的基因或插入的基因影響小鼠的生殖或直接引發(fā)致死，那么需要相應(yīng)地調(diào)整親代的基因型來避免繁育的中斷。

• 對(duì)于條件性過表達(dá)（Rosa26-LSL-geneX）這類小鼠模型，一般最終不需要flox純合子；Cre雜合子，只需要flox雜合子；Cre雜合子即可。因此繁育過程會(huì)簡(jiǎn)單很多。

• 對(duì)于利用廣泛表達(dá)的Cre或生殖細(xì)胞表達(dá)的Cre與flox小鼠交配來獲得全身性基因敲除小鼠，精子和/或卵母細(xì)胞中的flox序列會(huì)被Cre刪除，并將刪除后的等位基因傳遞給它們的后代。一旦證明Cre介導(dǎo)的序列敲除已經(jīng)傳遞給下一代，最好通過繁育的方法把Cre基因從子代當(dāng)中去除。

設(shè)計(jì)完繁育路線，我們就可以在此基礎(chǔ)上大致估算需要使用的小鼠數(shù)量與整體規(guī)模。成本與預(yù)算也就基本心里有數(shù)了。

這里有幾個(gè)系數(shù)會(huì)幫助我們估算完成整個(gè)繁育計(jì)劃所需小鼠的數(shù)量。

估算公式：

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如果您想了解更為詳細(xì)的繁育策略，也可以進(jìn)入資源與支持-產(chǎn)品手冊(cè)，查看手冊(cè)《基因工程小鼠定制與繁育常見問題解答》。