【熱門靶點】殊途同歸的CTLA4與PD1
CTLA-4
CTLA-4（cytotoxic T-lymphocyte-associated protein 4，也叫CD152）是免疫球蛋白超家族的成員，CTLA-4蛋白由CTLA-4基因編碼，位于人2號染色體（2q33.2），小鼠1號染色體。
1995年，Tak Wah Mak 和 Arlene H. Sharpe 兩家實驗室分別利用CTLA-4基因敲除小鼠模型發(fā)現(xiàn)了CTLA-4基因負(fù)調(diào)控T細(xì)胞活化的功能。
在活化的T細(xì)胞表面表達(dá)，與CD28（T細(xì)胞共激活因子）同源，兩者均可與抗原提呈細(xì)胞表面的CD80和CD86（也叫b7-1和b7-2）結(jié)合。CD28負(fù)責(zé)傳遞激活信號，活化T細(xì)胞；而CTLA-4負(fù)責(zé)傳遞抑制信號給T細(xì)胞，讓T細(xì)胞不會殺傷其它細(xì)胞，包括腫瘤細(xì)胞。并且CTLA-4與CD80和CD86的親和力要高得多，因此會競爭和阻斷CD28的激活作用。
在靜息的幼稚T細(xì)胞中，CTLA-4主要位于胞內(nèi)，TCR和CD28：B7結(jié)合產(chǎn)生的刺激信號通過含有CTLA-4的囊泡的胞吐作用誘導(dǎo)CTLA-4異位到細(xì)胞表面。 通過CTLA-4：B7競爭結(jié)合產(chǎn)生負(fù)調(diào)控信號，通過抑制IL-2產(chǎn)生和細(xì)胞周期進(jìn)展來防止T細(xì)胞的完全活化。
CTLA-4-mediated inhibition of T cells. (圖片來自Am J Clin Oncol. 2016 Feb;39(1):98-106.)
CTLA-4還參與其它的免疫控制途徑。 調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（Tregs）組成型表達(dá)CTLA-4，CTLA-4 KO小鼠模型中Tregs控制效應(yīng)T細(xì)胞的功能被削弱，說明CTLA-4對Tregs功能也很重要。有研究認(rèn)為Tregs控制效應(yīng)T細(xì)胞的一種機制是APC上B7配體的下調(diào)，導(dǎo)致CD28共刺激減少。
CTLA-4-mediated inhibition of Tregs. (圖片來自Am J Clin Oncol. 2016 Feb;39(1):98-106.)
PD-1
PD-1是共刺激受體B7 / CD28家族的成員，由PDCD1基因編碼，位于人2號染色體、小鼠1號染色體。
它通過與其配體程序性死亡配體1（PD-L1）和程序性死亡配體2（PD-L2）結(jié)合來調(diào)節(jié)T細(xì)胞活化。與CTLA-4信號傳導(dǎo)類似，PD-1結(jié)合抑制T細(xì)胞增殖， 和干擾素-γ（IFN-γ）、腫瘤壞死因子TNF-α和IL-2的產(chǎn)生，并降低T細(xì)胞存活率。PD-1及其配體是T細(xì)胞耗竭過程中最主要的抑制性受體。
PD-1-mediated inhibition of T cells. (圖片來自Am J Clin Oncol. 2016 Feb;39(1):98-106.)
CTLA-4 vs PD-1
相同之處
在活化的T細(xì)胞表面表達(dá)
表達(dá)水平受tcr信號影響
-
降低T細(xì)胞的增殖、葡萄糖代謝、細(xì)胞因子產(chǎn)生和存活
不同之處
| CTLA-4 | PD-1 |
| 在早期T細(xì)胞反應(yīng)（免疫致敏階段）起抑制作用，主要在淋巴組織 | 在T細(xì)胞反應(yīng)后期（免疫效應(yīng)階段）發(fā)揮作用，主要在外周組織 |
| 在T細(xì)胞表達(dá) | 除了T細(xì)胞以外，也在其它細(xì)胞中表達(dá)，如：B細(xì)胞、NK細(xì)胞、樹突細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞、上皮細(xì)胞等。 |
| 配體僅在抗原提呈細(xì)胞（APC）表達(dá) | 配體除了APC以外，也在其它免疫細(xì)胞中表達(dá)，如：PD-L1廣泛表達(dá)于多種細(xì)胞，常見于造血細(xì)胞，如T細(xì)胞、B細(xì)胞、DC細(xì)胞和巨噬細(xì)胞，以及非造血細(xì)胞，如血管和間質(zhì)血管內(nèi)皮細(xì)胞、胎盤合體滋養(yǎng)細(xì)胞和角質(zhì)細(xì)胞，也在腫瘤細(xì)胞中表達(dá)。相較之下，PD-L2的表達(dá)受到很大的限制，主要由DC細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和B細(xì)胞表達(dá)。 |
| 通過相較少途徑的T細(xì)胞信號通路發(fā)揮作用 | 通過更多途徑的T細(xì)胞信號通路發(fā)揮作用 |
| 影響Treg的功能 | 對Treg的作用尚不清楚 |
anti-CTLA-4 vs anti-PD-1
針對CTLA-4通路與PD-1/PD-L1通路的靶向藥物包括：
| 類型 | 名稱 | 公司 |
| CTLA-4 inhibitor | Ipilimumab | Bristol-Myers Squibb |
| Tremelimumab? |
Medimmune/Astrazeneca | |
| PD-1 inhibitor | Pembrolizumab? |
Merck |
Nivolumab? |
Bristol-Myers Squibb | |
| Pidilizumab | tionCureTech/Mediva |
|
| PD-L1 inhibitor | Durvalumab | Medimmune/Astrazeneca |
| Atezolimab | Roche |
利用CTLA-4抗體和PD-1抗體分別阻斷CTLA-4和PD-1之后，抗PD-1主要誘導(dǎo)特定腫瘤浸潤的耗竭CD8 T細(xì)胞亞群的擴(kuò)增；抗CTLA-4在此基礎(chǔ)上還誘導(dǎo)了ICOS+ Th1-like CD4 T細(xì)胞擴(kuò)增。雖然它們都會使CD8+ T細(xì)胞增加，但其實是各自通過不同的細(xì)胞機制來實現(xiàn)的：anti-PD-1主要是通過觸發(fā)線粒體氧化磷酸化途徑，而anti-CTLA-4則能觸發(fā)胞內(nèi)大多數(shù)信號途徑，其中還包括細(xì)胞周期調(diào)控途徑。
Anti-CTLA-4 and anti-PD-1 checkpoint- blockade therapies target distinct tumor- infiltrating T cell populations to induce tumor rejection.
盡管PD-1和CTLA-4靶向治療已經(jīng)能夠提高癌癥患者的平均預(yù)期壽命，但仍有諸多局限性。雖然CTLA-4抗體和PD-1抗體的聯(lián)合或順序療法正在火熱展開，但對于療效、用藥的持久性和副作用的研究都還剛剛起步，都凸顯出該領(lǐng)域進(jìn)一步創(chuàng)新的必要性。
構(gòu)建免疫檢驗點人源化小鼠模型，使科研人員能夠研究只識別人體免疫檢驗點的藥物。?人源化小鼠為研究靶定人體免疫檢驗點的檢驗點抑制劑提供了可能性，并且在臨床試驗前更精準(zhǔn)的預(yù)測藥物功效以及可能的副作用（如自身免疫，促炎癥等）。
南模生物已開發(fā)出CTLA-4、PD-1、PD-L1三種已驗證的人源化小鼠模型，用以測試靶向人體免疫檢驗點的藥物。
人源化小鼠及驗證數(shù)據(jù)
CTLA-4-HU
構(gòu)建策略
CTLA4人源化小鼠構(gòu)建策略。在 C57BL/6J 遺傳背景下，將人源 CTLA4 蛋白編碼序列插入小鼠 Ctla4 基因的 ATG 位置，在表達(dá)全人源 CTLA4 蛋白的同時取代小鼠內(nèi)源 Ctla4 的表達(dá)。
驗證數(shù)據(jù)
CTLA4人源化小鼠流式分析（FACS）數(shù)據(jù)
FACS 檢測CTLA4 人源化小鼠活化后脾臟淋巴細(xì)胞的CTLA4 表達(dá)。CTLA4 人源化純合子小鼠脾臟淋巴細(xì)胞經(jīng)anti-CD3 和anti-CD28刺激 72h 后收集細(xì)胞染色，F(xiàn)ACS 檢測人源CTLA4 表達(dá)。結(jié)果顯示：CTLA4 人源化純合子小鼠活化的CD4+ 和CD8+ T 淋巴細(xì)胞中可以檢測到人源CTLA4 的活躍表達(dá)。（與CrownBio 合作完成）
· CTLA4人源化小鼠MC38荷瘤模型體內(nèi)驗證結(jié)果
圖4.? CTLA4人源化小鼠模型的抗CTLA4人源化抗體Ipilimumab 體內(nèi)抗腫瘤效果。 (數(shù)據(jù)為與信達(dá)生物制藥有限公司合作完成)
分組和給藥以及檢測：將MC38結(jié)直腸癌細(xì)胞接種于CTLA-4轉(zhuǎn)基因小鼠右側(cè)背部皮下，成瘤后隨機分為2組，然后分別給予Ipilimumab 10 mg/kg或者等體積生理鹽水進(jìn)行治療，每周給藥2次，連續(xù)給藥4次，每次給藥前測定腫瘤體積。
實驗結(jié)果：抗human-CTLA4藥物Ipilimumab能夠顯著抑制MC38腫瘤在CTLA-4小鼠體內(nèi)的生長，給藥1周后即可檢測到腫瘤抑制效果，給藥2周后可見非常顯著的抑制效果（如上圖），同時Ipilimumab治療組有2只動物腫瘤完全消失，而對照組則腫瘤持續(xù)生長。
圖5. CTLA4人源化小鼠模型的抗CTLA4人源化抗體Ipilimumab 體內(nèi)抗腫瘤效果。 (數(shù)據(jù)為與PharmaLegacy合作完成)
CTLA4 人源化小鼠 MC38 荷瘤模型體內(nèi)抗腫瘤藥效驗證。CTLA4 人源化純合子小鼠接種 MC38 結(jié)腸癌細(xì)胞系，腫瘤生長至約 100 mm3隨機將動物分組為對照組和治療組（n=9）。結(jié)果顯示： 針對人的 CTLA4 陽性藥物 Yervoy 有非常顯著的抗腫瘤效果（p<0.001），證明CTLA4 人源化小鼠是一個很好的驗證針對人 CTLA4 抗體藥效的體內(nèi)模型。
PD-1-HU
構(gòu)建策略
PD-1人源化小鼠構(gòu)建策略。在 C57BL/6J 遺傳背景下，將人源 PDCD1 蛋白編碼區(qū)插入小鼠 Pdcd1 基因的 ATG 位置，在表達(dá)人源全長 PDCD1 蛋白的同時，取代小鼠內(nèi)源 Pdcd1 的表達(dá)。
驗證數(shù)據(jù)
· PD-1人源化小鼠T細(xì)胞流式分析（FACS）數(shù)據(jù)
PD-1人源化小鼠T細(xì)胞經(jīng)ConA激活后流式分析（與 Genscript
合作完成）。FACS 檢測 PD-1 人源化小鼠脾臟淋巴細(xì)胞 PD-1 表達(dá)。PD-1 人源化純合子小鼠和野生型小鼠取脾臟 T 淋巴細(xì)胞，體外
ConA 刺 激 24 小 時 后，F(xiàn)ACS 檢 測 人源 PD-1 在 T 細(xì)胞表面表達(dá)。結(jié)果顯示：ConA 體外刺激后，在 PD-1 人源化小鼠 T細(xì)胞表面可以檢測到人源 PD-1 蛋白表達(dá)。
· PD-1人源化小鼠MC38荷瘤模型體內(nèi)驗證結(jié)果
A. 腫瘤組織平均體積±SEM。（與 Genscript 合作完成）
PD-1 人源化小鼠 MC38 荷瘤模型體內(nèi)抗腫瘤藥效驗證。PD-1 人源化純合子小鼠接種 MC38 結(jié)腸癌細(xì)胞系，腫瘤生長至約 100 mm3隨機將動物分組為對照組和治療組（n=8），每周給藥兩次，連續(xù)給藥四次。結(jié)果顯示：針對人的 PD-1 陽性藥物 Keytruda 有非常顯著的抗腫瘤效果（p<0.001），證明 PD-1 人源化小鼠是一個很好的驗證針對人 PD-1 抗體藥效的體內(nèi)模型。
B. 腫瘤組織平均體積±SEM。C. 小鼠平均體重±SEM。 ( 與 PharmaLegacy 合作完成 )
PD-1 人源化小鼠MC38 荷瘤模型體內(nèi)抗腫瘤藥效劑量驗證。PD-1 人源化純合子小鼠接種 MC38 結(jié)腸癌細(xì)胞系，腫瘤生長至約 90 mm3隨機將動物分組為對照組和治療組（n=9）。結(jié)果顯示：針對人的 PD-1 抗體有非常顯著的抗腫瘤效果（p<0.001），且這種抗腫瘤效果呈現(xiàn)出劑量效應(yīng)。
PD-L1-HU
構(gòu)建策略
PD-L1人源化小鼠構(gòu)建策略。在 C57BL/6J 遺傳背景下，將人源 PD-L1 蛋白編碼序列插入小鼠 Pd-l1 基因的 ATG 位置，在表達(dá)全人源 PD-L1 蛋白的同時取代小鼠內(nèi)源 Pd-l1 的表達(dá)。
驗證數(shù)據(jù)
· PD-L1人源化小鼠T細(xì)胞流式分析（FACS）數(shù)據(jù)
FACS 檢測 PD-L1 人源化純合子小鼠和野生型小鼠脾臟淋巴細(xì)胞 PD-L1 表達(dá)。結(jié)果顯示：在人源化 PD-L1 純合子小鼠脾臟 T細(xì)胞和 B細(xì)胞中均可以檢測到人源PD-L1 的表達(dá)。（與 CrownBio 合作完成）
PD-L1人源化小鼠MC38荷瘤模型體內(nèi)驗證結(jié)果
PD-L1 人源化小鼠 MC38 荷瘤模型體內(nèi)抗腫瘤藥效驗證。PD-L1 人源化純合子小鼠接種 MC38 人源化結(jié)腸癌細(xì)胞系（表達(dá)人源 PDL1，不表達(dá)鼠源 PD-L1），腫瘤生長至約 100 mm3隨機將動物分組為對照組和治療組（n=5）。結(jié)果顯示： 針對人的 PD-L1 抗體有非常顯著的抗腫瘤效果（TGI: 抑瘤率 , p<0.01），證明 PD-L1 人源化小鼠是一個很好的驗證針對人 PD-L1 抗體藥效的體內(nèi)模型。
人源化小鼠訂購信息
| 名稱 | 目錄號 | 狀態(tài) |
| CTLA-4-HU | ? ?? ?? NM-HU-00014?????? |
? ? ? 活體 ??? |
| PD-1-HU | ?? ? ? NM-HU-00015?? ? ? |
? ?? 活體???? |
|
PD-L1-HU |
? ?? ? NM-HU-00062?????? |
? ?? 活體???? |
| PD-1&CTLA-4-HU | ? ?? ? NM-HU-00079?????? |
? ?? 活體 ? ? |
| ???????? PD-L1&CTLA-4-HU???????? |
? ?? ? NM-HU-00102??? ?? |
?? ? 活體 ? ? |
| PD-1&PD-L1-HU | ??? ?? NM-HU-00100?? ? ? |
?? ? 活體 ? ? |
參考文獻(xiàn)
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Parry RV, Chemnitz JM, Frauwirth KA, et al. CTLA-4 and PD-1 receptors inhibit T-cell activation by distinct mechanisms. Mol Cell Biol. 2005;25:9543–9553.
Wing K, Onishi Y, Prieto-Martin P, et al. CTLA-4 control over Foxp3+ regulatory T cell function. Science. 2008;322:271–275.
Chen DS, Irving BA, Hodi FS. Molecular pathways: next-generation immunotherapy—inhibiting programmed death-ligand 1 and programmed death-1. Clin Cancer Res. 2012;18:6580–6587.
Buchbinder EI, Desai A. CTLA-4 and PD-1 Pathways: Similarities, Differences, and Implications of Their Inhibition. Am J Clin Oncol. 2016 Feb;39(1):98-106.
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