斑馬魚(yú)不僅具有體積小，產(chǎn)卵量高，發(fā)育成熟時(shí)間短，飼養(yǎng)條件簡(jiǎn)單，易于培養(yǎng)等特點(diǎn)，她富有通透性的體表更讓我們可以輕松地在顯微鏡下觀察到各器官組織。

更厲害的是，如果能夠通過(guò)基因操作手段，將熒光蛋白導(dǎo)入到斑馬魚(yú)體內(nèi)，在特定的組織器官中表達(dá)，就可以輕松實(shí)現(xiàn)在熒光顯微鏡下觀察到特定器官的發(fā)育與生理變化，甚至可以動(dòng)態(tài)追蹤其胚胎發(fā)育全程以及外源性物質(zhì)或基因突變對(duì)器官發(fā)育的影響。

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Super star——抗腫瘤藥物靶點(diǎn)篩選利器——血管特異性熒光轉(zhuǎn)基因斑馬魚(yú)

血管特異性轉(zhuǎn)基因熒光斑馬魚(yú)能實(shí)現(xiàn)體內(nèi)脈管系統(tǒng)的高分辨率成像，并可以對(duì)血管生長(zhǎng)和重塑進(jìn)行長(zhǎng)期的跟蹤、重復(fù)成像，同時(shí)體內(nèi)血管仍持續(xù)正常發(fā)育。下圖中列舉了部分血管或血液熒光轉(zhuǎn)基因斑馬魚(yú)品系。

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Fig1. Zebrafish transgenic lines for time-lapse vascular imaging.（圖片來(lái)自The Zebrafish: Cellular and Developmental Biology）

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其中最為常用的當(dāng)屬fli1a:EGFP和kdrl:EGFP這兩種了。fli1a:EGFP轉(zhuǎn)基因斑馬魚(yú)中綠色熒光標(biāo)記血管和淋巴管，而kdrl:EGFP品系僅標(biāo)記血管內(nèi)皮細(xì)胞。fli1a:EGFP轉(zhuǎn)基因斑馬魚(yú)在血管生成、淋巴管生成、腫瘤形成、抗腫瘤藥物篩選與評(píng)價(jià)等領(lǐng)域都得到了廣泛的應(yīng)用。

Fig2. EGFP expression in the vasculature of live TG(fli1:EGFP) larvae and adults. 【圖片來(lái)自Developmental Biology 248, 307–318 (2002)】

血管生成機(jī)制或相關(guān)基因功能研究

利用fli1a:EGFP轉(zhuǎn)基因斑馬魚(yú)作為模型，應(yīng)用到血管生成機(jī)制研究或血管生成相關(guān)基因功能研究中時(shí)，我們既可以通過(guò)正向遺傳學(xué)方法，即對(duì)斑馬魚(yú)基因序列進(jìn)行大規(guī)模的隨機(jī)誘導(dǎo)突變，根據(jù)所獲得的突變表型而探尋發(fā)生突變的基因；也可以通過(guò)反向遺傳學(xué)方法，即對(duì)斑馬魚(yú)血管形成基因及相關(guān)調(diào)控基因等已知的基因片段進(jìn)行沉默或過(guò)表達(dá)，由此產(chǎn)生表型，確定基因功能。

例如：對(duì)某特定基因進(jìn)行Morpholino knockdown可抑制斑馬魚(yú)血管生成，說(shuō)明該基因在血管形成過(guò)程中發(fā)揮重要作用。

Fig3.?GeneX? knock down inhibits the trunk angiogenesis in zebrafish. (A-D) Representative fluorescent images of zebrafish embryos at 32h post-fertilization (hpf). (C-E) Compared with wild-type control, embryos injected with geneX-MO present a lower number of incomplete ISVs and only occasional sprouts (asterisk) of dorsal aorta. The boxed regions are shown at higher magnification in the right panels. DLAV, dorsal longitudinal anastomotic vessels; ISV, intersegmental vessels; DA, dorsal aorta; PCV, posterior cardinal vein.??

對(duì)bmp10基因進(jìn)行過(guò)表達(dá)可抑制斑馬魚(yú)血管生成，說(shuō)明該基因具有抑制血管形成過(guò)的作用。

Fig4. Nonmutant bmp10 overexpression inhibits the trunk angiogenesis in zebrafish.? (A-F) Representative bright field and fluorescent images of zebrafish embryos at 32h post-fertilization (hpf). Red arrow indicates haemorrhage in the tail (B). (C-H) Compared with wild-type control, nonmutant zebrafish bmp10 mRNA (200pg) injection present a lower number of incomplete ISVs and only occasional sprouts (asterisk) of dorsal aorta. The red boxed regions are shown at higher magnification in the right panels. DLAV, dorsal longitudinal anastomotic vessels; ISV, intersegmental vessels; DA, dorsal aorta; PCV, posterior cardinal vein.?

抗腫瘤或抗血管生成藥物篩選與評(píng)價(jià)

血管生成(angiogenesis)是癌癥治療的關(guān)鍵靶點(diǎn)。傳統(tǒng)用于抗血管藥物高通量篩選的方法主要有體外細(xì)胞模型，但是這種方法篩選出的結(jié)果和體內(nèi)實(shí)驗(yàn)相關(guān)性較差，而體內(nèi)模型主要有小鼠角膜袋（Corneal Micropocket Assay）和雞胚尿囊膜（Chick Chorioallantoic Membrane Assay），但這兩種方法操作難度大，費(fèi)時(shí)，耗力，成本高，實(shí)驗(yàn)周期長(zhǎng)，而且篩選藥物的通量很低，大量的研究證實(shí)，斑馬魚(yú)是目前最理想的血管生物學(xué)研究以及抗腫瘤血管生成藥物評(píng)價(jià)模型。利用血管特異性EGFP轉(zhuǎn)基因斑馬魚(yú)可以成功實(shí)現(xiàn)在96孔板或者384孔板中進(jìn)行抗血管新藥或者新藥靶點(diǎn)的體內(nèi)高通量和高內(nèi)涵篩選。

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Fig5. Screening and evaluation of anti-tumor or anti-angiogenic drugs.

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例如：

貝伐單抗/Bevacizumab（商品名-阿瓦斯汀/Awastin），2017年銷(xiāo)售額71.41億美元），由羅氏/基因泰克公司最先研發(fā)成功，2004年2月26日獲得美國(guó)FDA批準(zhǔn)上市，是全球第一支治療型抗血管生成單克隆抗體藥物，一線治療結(jié)直腸癌。

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貝伐單抗至今缺乏體內(nèi)抗血管生成的藥效學(xué)數(shù)據(jù)。

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南模生物斑馬魚(yú)技術(shù)服務(wù)平臺(tái)，首次利用斑馬魚(yú)血管模型全面快速評(píng)估了貝伐單抗-Bevacizumab的抗血管功效：貝伐單抗能夠有效抑制斑馬魚(yú)腸下血管（SIV）和視網(wǎng)膜血管的生長(zhǎng)，為臨床試驗(yàn)提供了新的可靠依據(jù)。南模生物斑馬魚(yú)平臺(tái)與瑞金醫(yī)院呼吸科高蓓莉課題組合作的這一成果，在線發(fā)表于2018年8月份的國(guó)際知名藥物研發(fā)期刊-《Drug Des Devel Ther. 》

Fig6. Bevacizumab impairs formation of zebrafish SIV in a dose-dependent manner. Notes: Representative fluorescent images of control or embryos treated with bevacizumab at 3 dpf. In control embryos, SIVs developed as a smooth basket-like structure over the yolk at 3 dpf (A, yellow dashed lines). In contrast, embryos treated with bevacizumab resulted in specific defects in SIVs formation (B, C, white dashed lines). (D, E) Quantification of the area and number of SIV show significant decrease in bevacizumab-treated embryos. Error bars, SEM; *P0.0001 (n=10; ANOVA).

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Fig7. Bevacizumab causes specific vasculature formation defects in the SIV. Notes: (A–D) Representative fluorescent images of zebrafish embryos at 3 dpf treated with PBS (control) or bevacizumab (2 mg/mL). (A, B) In contrast, treatment with bevacizumab at the pectoral fin stage (2.5 dpf) causes specific vasculature formation defects in the SIV (B, white arrow). (C–D) Truncal vasculature of the zebrafish shows no appreciable phenotypic differences relative to control.

如何構(gòu)建組織特異性熒光轉(zhuǎn)基因斑馬魚(yú)？

除了血管特異性熒光斑馬魚(yú)以外，還能有標(biāo)記其它器官嗎？比如心臟啦、肝臟啦、淋巴細(xì)胞啦？

當(dāng)然可以！只要借助斑馬魚(yú)轉(zhuǎn)基因技術(shù)，就可以實(shí)現(xiàn)穩(wěn)定的蛋白表達(dá)或是特定組織中目標(biāo)蛋白的可調(diào)控表達(dá)。最常用的斑馬魚(yú)轉(zhuǎn)基因系統(tǒng)是來(lái)源于青鳉的Tol2轉(zhuǎn)座子體系。

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將帶有轉(zhuǎn)座子的供體質(zhì)粒與編碼轉(zhuǎn)座酶的mRNA一起通過(guò)顯微注射注入到單細(xì)胞階段斑馬魚(yú)胚胎中，轉(zhuǎn)座酶催化Tol2轉(zhuǎn)座子通過(guò)”剪切-粘貼“的方式進(jìn)行轉(zhuǎn)座，將轉(zhuǎn)座子載體中的目的片段（組織特意性啟動(dòng)子-熒光蛋白）整合到斑馬魚(yú)基因組中。注射過(guò)的胚胎經(jīng)培養(yǎng)后再?gòu)某婶~(yú)中篩選出在生殖細(xì)胞系中有插入片段并能傳遞到下一代的轉(zhuǎn)基因斑馬魚(yú)。

Fig8. Schematic diagram of establishing a specific promoter driven EGFP transgenic zebrafish model.

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例如：

肝臟特異性EGFP綠色熒光轉(zhuǎn)基因斑馬魚(yú)模型Tg(fabp10a:EGFP)：

Fig9. Tg(fabp10a:EGFP) transgenic zebrafish model generated by SMOC.

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巨噬細(xì)胞標(biāo)記EGFP綠色熒光轉(zhuǎn)基因斑馬魚(yú)模型Tg(zlyz:EGFP)：

Fig10. Tg(zlyz:EGFP) transgenic zebrafish model generated by SMOC.