【小鼠大學(xué)問(wèn)】體內(nèi)內(nèi)源基因調(diào)控之CRISPRi與CRISPRa
眾所周知，CRISPR/Cas9系統(tǒng)可以用來(lái)操縱基因組：規(guī)律成簇的間隔短回文重復(fù)CRISPR與內(nèi)切酶Cas9的組合，可以在引導(dǎo)RNA（gRNA）的指引下，靶向基因組中的特定區(qū)域并切割DNA，產(chǎn)生DNA雙鏈斷裂（DSB）。
自2013年，CRISPR/Cas9系統(tǒng)的應(yīng)用又得到了更廣泛的擴(kuò)展，我們可以將Cas9帶到特定的基因組位點(diǎn)，通過(guò)起始或停止轉(zhuǎn)錄來(lái)調(diào)控靶基因，達(dá)到激活或抑制基因表達(dá)的目的
從“CRISPR編輯”到“CRISPR調(diào)節(jié)”
實(shí)現(xiàn)這種轉(zhuǎn)變的核心仍舊是Cas9，只是編輯基因組需要具有內(nèi)切酶活性的Cas9蛋白，而調(diào)節(jié)基因表達(dá)時(shí)需要催化功能失活的“dead”Cas9 —— dCas9。這種突變（D10A，H840A）的Cas9蛋白雖然不能進(jìn)行DNA雙鏈的切割，但仍舊可以在gRNA的指導(dǎo)下與特定靶向的DNA緊緊結(jié)合。
圖1. dCas9結(jié)構(gòu)示意圖。
當(dāng)使用dCas9蛋白與不同的效應(yīng)結(jié)構(gòu)域連接，而gRNA與我們想要抑制或激活的靶基因區(qū)域互補(bǔ)時(shí)，我們就可以利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)來(lái)調(diào)節(jié)靶基因的表達(dá)了。
圖2. dCas9介導(dǎo)的基因調(diào)控系統(tǒng)。圖片來(lái)自：Cell. 2013 Jul 18; 154(2): 442–451.
CRISPRi
CRISPRi也稱為CRISPR干擾 (CRISPR interference or inhibition) 。dCas9與轉(zhuǎn)錄抑制子連接，如KRAB（Kruppel associated box），dCas9-KRAB融合蛋白在gRNA指引下，結(jié)合到靶基因TSS位點(diǎn)，抑制轉(zhuǎn)錄起始，沉默靶基因的表達(dá)。
圖3. CRISPRi系統(tǒng)示意圖。圖片來(lái)自: ACS Chem Biol. 2018 Feb 16;13(2):406-416.?
CRISPRi 研究案例
dCas9融合KRAB的CRISPRi系統(tǒng)（dCas9-KRAB）在海馬神經(jīng)元中能有效地靶向抑制功能基因的表達(dá)，基因沉默水平顯著優(yōu)于傳統(tǒng)RNAi技術(shù)。
Fig1. CRISPRi efficiently inactivates gene expression in primary neurons.
利用神經(jīng)元亞群特異性的啟動(dòng)子條件性CRISPRi能精確控制功能基因Syt1在海馬齒狀回興奮性和抑制性神經(jīng)元中喪失功能而不影響Syt1在其它類型細(xì)胞中的表達(dá)。
Fig2.?CRISPRi-based conditional inactivation of Syt1 shifts the E-I balance of the DG.
針對(duì)Syt1及其互作蛋白網(wǎng)絡(luò)的基因Syb2，Stx1a/b和SNAP25a的多重基因CRISPRi系統(tǒng)能夠在小鼠腦內(nèi)實(shí)現(xiàn)靈活多變的多基因不同組合的高效失活。
Fig3.?Flexible multiplex gene silencing using CRISPRi in the mouse brain.
最新的研究在dCas9-KRAB的基礎(chǔ)上進(jìn)行優(yōu)化，發(fā)現(xiàn)dCas9-KRAB-MeCP2能夠更高效地對(duì)靶基因表達(dá)的抑制。
Fig4.?Repression of endogenous genes by dCas9–KRAB–MeCP2.
參考文獻(xiàn)：
Zheng Y, Shen W, Zhang J, Yang B, et al. CRISPR interference-based specific and efficient gene inactivation in the brain.Nat Neurosci. 2018 Mar;21(3):447-454.?
Yeo NC, Chavez A, Lance-Byrne A, Chan Y，et al. An enhanced CRISPR repressor for targeted mammalian gene regulation. Nat Methods. 2018 Jul 16. doi: 10.1038/s41592-018-0048-5.
CRISPRa
CRISPRa也稱為CRISPR激活 (CRISPR activation) 。讓dCas9與不同的轉(zhuǎn)錄激活子結(jié)合發(fā)揮上調(diào)靶基因表達(dá)的作用。例如，直接與單個(gè)轉(zhuǎn)錄激活因子（例如dCas9-VP64或dCas9-VP16）融合表達(dá)，不過(guò)單轉(zhuǎn)錄激活因子對(duì)靶基因地激活水平降低。為了更好地提高過(guò)表達(dá)的水平，可將多個(gè)轉(zhuǎn)錄激活因子共同招募到靶基因TSS位點(diǎn)：如多拷貝VP64與dCas9的融合、三元轉(zhuǎn)錄激活因子VPR（VP64-p65-Rta）融合到dCas9末端。
除了將轉(zhuǎn)錄激活因子直接與dCas9融合以外，還可以通過(guò)分子掛鉤來(lái)招募轉(zhuǎn)錄激活因子到dCas9周圍，如：將SunTag短肽（含多拷貝的GCN4激活招募結(jié)構(gòu)域）與dCas9融合，來(lái)招募scFvGCN4-sfGFP-VP64?；蚶肧AM系統(tǒng)，將MS2發(fā)夾結(jié)構(gòu)融合到gRNA上，招募激活輔助蛋白（MS2-p65-HSF1）到dCas9-VP64融合蛋白上，提高激活效率。
圖4. CRISPRa系統(tǒng)示意圖。圖片來(lái)自: ACS Chem Biol. 2018 Feb 16;13(2):406-416.?
在今年初的Nature Neuroscience上，一種新的CRISPRa系統(tǒng)被建立并應(yīng)用——dCas9-SPH。將SunTag-p65-HSF1與dCas9融合，并利用Cre-loxP系統(tǒng)，建立了一種可受Cre誘導(dǎo)的dCas9-SPH轉(zhuǎn)基因小鼠。
CRISPRa 研究案例
dCas9-VPR
dCas9與轉(zhuǎn)錄激活因子融合轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)結(jié)果顯示，融合三個(gè)轉(zhuǎn)錄激活因子的增強(qiáng)的效果明顯高于融合單個(gè)轉(zhuǎn)錄激活因子。
Fig1.?Serial fusion of activation domains to dCas9.
VPR連接順序是轉(zhuǎn)錄激活的影響因子，當(dāng)順序?yàn)閂P64-p65-Rta時(shí)，轉(zhuǎn)錄激活效果最明顯。
Fig2.?Testing the effects of VP64, p65 and Rta order on activation.
檢測(cè)人類293T細(xì)胞中的MIAT、NEUROD1、ASCL1、RHOXF2、TTN、ACTC1基因，結(jié)果顯示dCas9結(jié)合轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)子對(duì)不同的基因激活程度不同。
Fig3.?Gene activation using VPR.?
參考文獻(xiàn)：
Chavez A, Scheiman J, Vora S, Pruitt BW, et al. Highly efficient Cas9-mediated transcriptional programming. Nat Methods. 2015 Apr;12(4):326-8.?
dCas9-SPH
將SunTag-p65-HSF1 (SPH)融合到dCas9蛋白上，分別在人和小鼠的細(xì)胞里驗(yàn)證了dCas9-SPH系統(tǒng)的高效性以及特異性。
Fig1.?Design of an improved activator SPH.
Fig2.?mCherry driven by a minimal CMV promoter was activated in HEK293T and N2a cells by the indicated dCas9 activation systems.?
構(gòu)建受Cre重組酶調(diào)控的dCas9-SPH轉(zhuǎn)基因小鼠，在dCas9-SPH小鼠的原代細(xì)胞里導(dǎo)入sgRNA可以激活基因和長(zhǎng)鏈非編碼RNA。
Fig3. Generation of a Cre-dependent SPH transgenic mouse and activation of genes and lncRNAs in primary cells.
通過(guò)向dCas9-SPH轉(zhuǎn)基因小鼠腦部定點(diǎn)注射靶向三個(gè)轉(zhuǎn)錄因子（ANN）Ascl1，Neurog2、Neurod1的AAV-sgRNA，結(jié)果顯示ANN轉(zhuǎn)錄因子顯著上調(diào)，星形膠質(zhì)細(xì)胞可以直接被轉(zhuǎn)化為功能性神經(jīng)元。
Fig4.?SPH-based targeted activations convert astrocytes into functional neurons in vivo.?
向dCas9-SPH轉(zhuǎn)基因小鼠腦部定點(diǎn)注射靶向多個(gè)基因以及長(zhǎng)鏈非編碼RNA的AAV-sgRNA陣列，可實(shí)現(xiàn)多個(gè)基因在神經(jīng)元內(nèi)的同時(shí)激活。
Fig5.?Complex transcriptional activation in the intact brain using a single sgRNA array.
參考文獻(xiàn)：
Zhou H, Liu J, Zhou C, Gao N, et al. In vivo simultaneous transcriptional activation of multiple genes in the brain using CRISPR-dCas9-activator transgenic mice. Nat Neurosci. 2018 Mar;21(3):440-446.
CRISPR調(diào)節(jié)基因組的應(yīng)用
基因表達(dá)降低（Knockdown）：適用于編碼和非編碼基因?？膳cCRISPR-KO或RNAi互補(bǔ)。
基因過(guò)表達(dá)（Overexpression）：適用于編碼和非編碼基因?？蓪?shí)現(xiàn)基因在內(nèi)源環(huán)境中過(guò)表達(dá)。
基因定位：dCas9與熒光蛋白融合表達(dá)，可以對(duì)靶基因所在的染色體定位進(jìn)行示蹤。
誘導(dǎo)iPS：可利用CRISPRi來(lái)誘導(dǎo)iPS，或大規(guī)模篩選細(xì)胞全能性相關(guān)基因。
高通量遺傳篩選：可以利用CRISPRi/CRISPRa找到腫瘤細(xì)胞中的調(diào)節(jié)通路或易感基因、鑒定組織發(fā)育或細(xì)胞分化中的重要基因。
CRISPR調(diào)節(jié)基因組的優(yōu)勢(shì)
dCas9介導(dǎo)的基因調(diào)控是可逆的，不會(huì)永久性地修飾基因組DNA。
CRISPRi/CRISPRa復(fù)合物必須在轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)附近才能發(fā)揮作用，因此降低了脫靶效應(yīng)。
設(shè)計(jì)多條gRNAs可同時(shí)對(duì)多個(gè)靶基因進(jìn)行調(diào)控。
CRISPRi的作用類似于RNAi，但又不同于RNAi。RNAi針對(duì)成熟的RNA，而CRISPRi則是在DNA水平阻止轉(zhuǎn)錄的起始。因此，與RNAi相比，可靶向lncRNA、microRNA、反向轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物、細(xì)胞核內(nèi)的轉(zhuǎn)錄本等，是研究非蛋白編碼基因的有力工具。
CRISPR調(diào)節(jié)基因組的局限性
PAM序列在一定程度上限制了結(jié)合靶序列的數(shù)量。
染色體狀態(tài)和修飾可能會(huì)影響dCas9-gRNA與DNA的結(jié)合。
哺乳動(dòng)物細(xì)胞中，不同基因的CRISPRi/CRISPRa的效率差異性較大。
當(dāng)靶基因的靶序列與其它基因重疊，或受雙向啟動(dòng)子調(diào)節(jié)時(shí)，CRISPRi/CRISPRa的調(diào)控可能會(huì)影響到周邊的基因表達(dá)。
dCas9介導(dǎo)的體內(nèi)基因沉默/激活工具小鼠來(lái)啦！
南模生物dCas9系列工具鼠，可幫助研究者實(shí)現(xiàn)多靶點(diǎn)、可逆、內(nèi)源蛋白編碼基因以及長(zhǎng)鏈非編碼RNA的調(diào)控。
CRISPRi 工具鼠
CAG-LSL-KRAB-dCas9
品系全名：C57BL/6J-Gt(ROSA)26Sorem1(CAG-LSL-KRAB-dCas9-IRES-EGFP)Smoc
目錄號(hào)：NM-KI-18007
品系描述：將CAG-LSL-2xKRAB-dCas9-IRES-EGFP-WPRE-pA定點(diǎn)插入到小鼠Rosa26基因中，建立受Cre表達(dá)誘導(dǎo)的CRISPRi基因表達(dá)調(diào)控工具小鼠。與Cre工具鼠交配后，在Cre表達(dá)的細(xì)胞內(nèi)，可通過(guò)gRNA靶向并沉默目的基因。
CRISPRa 工具鼠
CAG-LSL-dCas9-VPR
品系全名：C57BL/6J-Gt(ROSA)26Sorem1(CAG-LSL-dCas9-VPR-IRES-EGFP-WPRE-pA)Smoc
目錄號(hào)：NM-KI-18004
品系描述：將CAG-LoxP-STOP-LoxP-dCas9-VP64-p65-Rta-IRES-EGFP-WPRE-polyA結(jié)構(gòu)插入到Rosa26基因中，建立受Cre表達(dá)誘導(dǎo)的CRISPRa基因表達(dá)調(diào)控工具小鼠。與Cre工具鼠交配后，在Cre表達(dá)的細(xì)胞內(nèi)，可通過(guò)gRNA靶向并增強(qiáng)目的基因的表達(dá)。
TRE3G-dCas9-VPR
品系全名：C57BL/6J-Col1a1em1(TRE3G-dCas9-VPR-eGFP-pA)Smoc
目錄號(hào)：NM-KI-00123
品系描述：將TRE3G-dCas9-VP64-p65-Rta-eGFP-pA四環(huán)素調(diào)控表達(dá)dCas9激活元件插入到安全位點(diǎn)Col1a1位點(diǎn)中。與rtTA工具鼠交配后，可在強(qiáng)力霉素dox誘導(dǎo)下在rtTA表達(dá)的細(xì)胞中，通過(guò)gRNA靶向并增強(qiáng)目的基因的表達(dá)。
CAG-LSL-dCas9-SPH
品系全名：C57BL/6-Tg(CAG-LSL-dCas9-SPH)Smoc
目錄號(hào)：NM-TG-00025
品系描述：通過(guò)piggyBac轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)建立CAG-LSL-dCas9-HA-SunTag-p65-HSF1-EGFP-WPRE-polyA轉(zhuǎn)基因小鼠。dCas9-SPH的表達(dá)受Cre重組酶調(diào)控，與Cre工具鼠交配后，在Cre表達(dá)的細(xì)胞內(nèi)，可通過(guò)gRNA靶向并增強(qiáng)目的基因的表達(dá)。
參考文獻(xiàn)
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Zalatan JG, Lee ME, Almeida R, Gilbert LA, et al. Engineering complex synthetic transcriptional programs with CRISPR RNA scaffolds. Cell. 2015 Jan 15;160(1-2):339-50.?
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