什么是Safe Harbor？

20 世紀(jì) 90 年代末 Philipe Soriano 及其同事發(fā)現(xiàn)，一個(gè)被命名為 ROSAβgeo26 的隨機(jī)轉(zhuǎn)基因小鼠品系在所有組織中都能檢測到高水平的β半乳糖苷酶表達(dá)。他們對這種轉(zhuǎn)基因小鼠進(jìn)行了基因插入的定位，確定了在第6號(hào)染色體的基因整合，也就是我們現(xiàn)在常說的Rosa26位點(diǎn)。雖然帶有外源插入片段的純合子小鼠的出生率略低于雜合子幼崽，但純合子小鼠也能正常發(fā)育和繁殖，對小鼠和細(xì)胞無害。自此，Rosa26位點(diǎn)被用于基因安全敲入并能保證轉(zhuǎn)入基因的正常穩(wěn)定表達(dá)?！窼afe Harbor 」安全港位點(diǎn)的概念由此被普及。

除了Rosa26以外，還有哪些位點(diǎn)可以安全地進(jìn)行外源基因插入并高效表達(dá)呢？

已經(jīng)有多個(gè)可用于哺乳動(dòng)物外源基因插入的基因組「Safe Harbor」被發(fā)現(xiàn)并應(yīng)用到人、小鼠、大鼠、兔子、豬的可調(diào)控或可逆基因過表達(dá)，例如：AAVS1、CCR5、HPRT、H11、Col1a1、TIGRE等等。

H11位點(diǎn)

H11位點(diǎn)（也叫Hipp11）位于小鼠第11號(hào)染色體，是 Eif4enif1與Drg1 這兩個(gè)基因之間的一個(gè)位點(diǎn)，由 Simon Hippenmeyer于2010 年發(fā)現(xiàn)并命名。由于H11位點(diǎn)位于兩個(gè)基因之間，故外源基因插入后影響內(nèi)源基因表達(dá)的風(fēng)險(xiǎn)很小。同時(shí)H11位點(diǎn)所在的Eif4enif1與Drg1這兩個(gè)基因的側(cè)翼序列區(qū)域具有廣泛的空間和時(shí)間EST（expression sequence tag）表達(dá)模式，能夠使整合在此的外源基因受指定啟動(dòng)子的驅(qū)動(dòng)而穩(wěn)定表達(dá)。該位點(diǎn)的純合敲入小鼠可正常發(fā)育和繁殖。因此成為可與Rosa26位點(diǎn)相媲美的新「Safe Harbor」。

和Rosa26位點(diǎn)的過表達(dá)模型一樣，在H11位點(diǎn)我們也可以采用CRISPR/Cas9技術(shù)構(gòu)建條件性基因過表達(dá)小鼠模型，即廣泛型強(qiáng)啟動(dòng)子pCAG與外源目的基因cDNA之間用loxP-STOP-loxP結(jié)構(gòu)隔開，只有與組織特異性Cre工具鼠交配后，才會(huì)在特異細(xì)胞或組織中表達(dá)目的基因。

Col1a1位點(diǎn)

Col1a1位點(diǎn)是2006年由Caroline Beard首先使用作為四環(huán)素誘導(dǎo)調(diào)控外源基因表達(dá)的整合位點(diǎn)。Col1a1位點(diǎn)實(shí)際上位于第11號(hào)染色體的Col1a1基因3‘UTR下游約500bp左右。在四環(huán)素調(diào)控模型中，在TetO啟動(dòng)子之前往往加上SA-polyA來阻隔上游啟動(dòng)子的影響，防止不依賴于四環(huán)素的轉(zhuǎn)錄調(diào)控。

圖3. Col1a1定點(diǎn)插入位點(diǎn)示意圖。

圖4. Col1a1位點(diǎn)四環(huán)素調(diào)控可逆過表達(dá)模式圖。

例如，Col1a1-tetO-EGFP與Rosa26啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的rtTA工具鼠交配后，通過dox誘導(dǎo)，在小鼠體內(nèi)可高效誘導(dǎo)EGFP的表達(dá)，且EGFP的表達(dá)譜與Rosa26啟動(dòng)子表達(dá)譜相一致。不過值得注意的是，在骨骼肌、腦組織和睪丸組織中沒有EGFP的表達(dá)，后兩者可能是由于血腦屏障和血睪屏障的關(guān)系。

圖5. Col1a1位點(diǎn)dox誘導(dǎo)EGFP表達(dá)情況。

圖6. Col1a1位點(diǎn)dox誘導(dǎo)EGFP表達(dá)概況表。

TIGRE位點(diǎn)

TIGRE是tightlyregulated 的縮寫，也是一個(gè)適用于四環(huán)素調(diào)控的整合位點(diǎn)，位于小鼠第9號(hào)染色體AB124611 和 Carm1兩個(gè)基因之間。

TIGRE-TetO-LacZ與MMTV-tTA工具鼠交配后，在大多數(shù)主要組織臟器中，都可以檢測到報(bào)告基因LacZ的表達(dá)。

和Col1a1位點(diǎn)類似，最好在TetO-cDNA-polyA兩側(cè)加上隔離子來減少不依賴于四環(huán)素的本底表達(dá)。

好的，常用的定點(diǎn)整合位點(diǎn)（Safe Harbors）先給大家普及這么多，如果想要了解更多可以在下方留言區(qū)互動(dòng)，也可在公眾號(hào)內(nèi)回復(fù)「學(xué)問」，查看更多小鼠大學(xué)問系列干貨！

References

1. Zambrowicz BP, Imamoto A, et al.Disruption of overlapping transcripts in the ROSA beta geo 26 gene trap strain leads to widespread expression of beta-galactosidase in mouse embryos and hematopoietic cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 1997 Apr 15;94(8):3789-94.

2. Hippenmeyer S , Youn YH , et al. Genetic Mosaic Dissection of Lis1 and Ndel1 in Neuronal Migration. Neuron. 2010 Nov 18; 68(4): 695–709.

3. Tasic B, Hippenmeyer S, et al.Site-specific integrase-mediated transgenesis in mice via pronuclear injection. Proc Natl Acad Sci U S A. 2011 May 10; 108(19): 7902–7907.

4. Tasic B, Miyamichi K,et al.Extensions of MADM (Mosaic Analysis with Double Markers) in Mice. PLoS One. 2012; 7(3): e33332.

5. Beard C, Hochedlinger K, et al. Efficient method to generate single-copy transgenic mice by site-specific integration in embryonic stem cells.Genesis. 2006 Jan;44(1):23-8.

6. Hochedlinger K, Yamada Y, et al.Ectopic Expression of Oct-4 Blocks Progenitor-Cell Differentiation and Causes Dysplasia in Epithelial Tissues. Cell. 2005 May 6;121(3):465-77.

7. Zeng H, Horie K, et al. An inducible and reversible mouse genetic rescue system. PLoS Genet. 2008 May; 4(5): e1000069.

8. Linda Madisen, Aleena R. Garner, et al. Transgenic mice for intersectional targeting of neural sensors and effectors with high specificity and performance. Neuron. 2015 Mar 4; 85(5): 942–958.