小鼠受精卵（早期胚胎）采集在基因工程小鼠的制備和保種中都是非常重要的步驟。只有采集到足夠數(shù)量和質(zhì)量的受精卵，才能更有效地進(jìn)行顯微注射、胚胎移植或凍存復(fù)蘇，保證獲得高質(zhì)量的子代小鼠。

那么受精卵到底是怎么采集的呢？今天我們就來介紹一下1細(xì)胞期與2細(xì)胞期胚胎的收集方法。

哺乳動(dòng)物的受精過程發(fā)生在輸卵管內(nèi)，小鼠胚胎進(jìn)入子宮著床時(shí)間大約為4天左右。因此，需要在配種后或受精后的適當(dāng)時(shí)間從超排供體收集不同時(shí)期的胚胎。

小鼠受精后4.5天內(nèi)早期胚胎發(fā)育的過程：

人、小鼠、大鼠胚胎發(fā)育階段對(duì)應(yīng)時(shí)間點(diǎn)：

受精卵獲得的方法分自然排卵、激素誘發(fā)排卵和體外受精三種方法。我們今天介紹的是誘發(fā)排卵（超排）后采集受精卵的方法。

誘發(fā)排卵（超排）后采集受精卵的方法

雌鼠超排與合籠

超排

不同背景的小鼠超排周齡都是不同的，劑量也是不同的。那以常用的C57小鼠為例，超排周齡為3-4周齡。當(dāng)達(dá)到超排周齡后，向雌小鼠腹腔內(nèi)注射5個(gè)國際單位(IU)的孕馬血清促性腺激素(PMSG)，然后約46-48h后再注射5 IU的人絨毛膜促性腺激素(hCG)，12h后即可誘發(fā)排卵。

合籠

1） 雌小鼠給予hCG后與成熟雄性小鼠進(jìn)行合籠。雄鼠交配一般是在夜晚發(fā)生，交配過程中建議不換籠，交配過的雄小鼠，間隔一周后才進(jìn)行下次交配。

2） 交配后過夜易見小鼠的陰道栓。

1-cell期胚胎采集

輸卵管切開

1） 通過斷頸快速處死見栓0.5天的小鼠。

2） 將小鼠背部靠尾部剃毛并用70%的乙醇徹底涂搽手術(shù)部位。

3） 用眼科鑷捏緊正中線皮膚，用外科剪剪出一個(gè)橫切口，鈍性分離皮膚與肌肉，充分暴露背側(cè)腰部肌肉。

4） 卵巢位于脊柱兩側(cè)隱約可見的白色脂肪團(tuán)的下方，用眼科鑷拎起脂肪團(tuán)上腹膜，眼科剪在此處開一小口，用鑷子夾住脂肪墊，輕輕地將子宮、輸卵管、卵巢拉出體腔。

5） 用眼科鑷將輸卵管、卵巢和脂肪團(tuán)拉伸，用眼科剪在輸卵管和卵巢之間剪開，重新定位眼科鑷的位置，然后在靠近輸卵管的子宮部剪開，將斷離的輸卵管放入預(yù)先準(zhǔn)備好的小玻璃皿中的 M2 液滴中。對(duì)另一側(cè)輸卵管重復(fù)上面操作。

離體輸卵管內(nèi)受精卵的收集與處理

1） 用眼科鑷撕開輸卵管膨大的壺腹部，即看到包繞受精卵的丘細(xì)胞團(tuán)。游離的受精卵慢慢流出，也可以用鑷子輕輕擠壓輸卵管將受精卵推出裂口。

2） 全部卵群取出后，將其轉(zhuǎn)移到一個(gè)約 200ul 的液滴中，加入 10-15ul 的 500U/ml 透明質(zhì)酸酶（hyaluronidase）消化顆粒細(xì)胞，約30秒-1分鐘，必要時(shí)用毛細(xì)管吹打卵群數(shù)次。如顆粒細(xì)胞全部脫落，則開始清洗步驟；如仍有部分未脫落則再等待數(shù)十秒直到全部脫落。

3） 洗滌：用玻璃細(xì)管（直徑約120um-250um，即大于一個(gè)受精卵的直徑而小于二個(gè)受精卵的直徑）把受精卵在新的 M2 液滴中轉(zhuǎn)移五次，洗去顆粒細(xì)胞、殘?jiān)巴该髻|(zhì)酸酶，將洗好的受精卵轉(zhuǎn)移到覆蓋有礦物油（可防止污染同時(shí)防止培養(yǎng)基水分蒸發(fā)影響pH）的 M16 液滴（在 5%CO2、37℃培養(yǎng)箱中平衡過夜，保證正確 pH 值）中，再放入 5%CO2、37℃培養(yǎng)箱中備用。

2-cell期胚胎采集的時(shí)間

與1-cell期胚胎的采集不同之處在于：

1） 使用見栓1.5天的供體雌鼠。

2） 將斷離的輸卵管放入預(yù)先準(zhǔn)備好的小玻璃皿中的 M2 液滴中后，使用吸有 M2 的注射器配鈍口的4#針頭，插入輸卵管，僅沖洗輸卵管部分，收集胚胎。并將胚胎洗滌干凈，洗去血細(xì)胞及殘?jiān)龋瑢⑾春玫呐咛マD(zhuǎn)移到覆蓋有礦物油的 M16 液滴中，再放入 5%CO2、37℃ 培養(yǎng)箱備用。

M2 和 M16培養(yǎng)基

M2與M16都是化學(xué)成份明確的培養(yǎng)基（chemically defined medium；CDM）。CDM含胚胎需要、能維持和胚胎生長(zhǎng)發(fā)育，分裂繁殖的化學(xué)成分：多種鹽離子、能量物質(zhì)、生長(zhǎng)因子、動(dòng)物白蛋白或含蛋白等大分子的各種動(dòng)物血清。

標(biāo)準(zhǔn)的M16在上世紀(jì)70年代初定型，現(xiàn)已商業(yè)化，是世界各地實(shí)驗(yàn)室仍常用于小鼠胚胎實(shí)驗(yàn)的一種CDM。M2是在M16基礎(chǔ)上添加了HEPES(4-羥乙基哌嗪乙磺酸)。利用HEPES可適當(dāng)延長(zhǎng)培養(yǎng)基和其中培養(yǎng)物在自然環(huán)境下(二氧化碳培養(yǎng)箱外)的使用時(shí)間。因其可較長(zhǎng)時(shí)間維持一定的pH平衡，便于自然環(huán)境下操作應(yīng)用。M2更適于小鼠等動(dòng)物在采集卵母細(xì)胞，或胚胎在相對(duì)較長(zhǎng)時(shí)間的體外操作等環(huán)節(jié)應(yīng)用。