生物發(fā)光 Bioluminescence

要讓小鼠自發(fā)光，靠的是生物發(fā)光過程，也就是讓熒光素酶催化底物氧化反應(yīng)，產(chǎn)生發(fā)射光。

我們可以將熒光素酶（luciferase）基因，如：螢火蟲熒光素酶，整合到細(xì)胞或動物 DNA 中以表達熒光素酶，在ATP、鎂離子和氧氣存在的條件下，外源給予底物熒光素（luciferin），熒光素酶催化底物氧化反應(yīng)產(chǎn)生發(fā)射光。只有活細(xì)胞內(nèi)才會產(chǎn)生發(fā)光現(xiàn)象，且光的強度與標(biāo)記細(xì)胞的數(shù)目成正比。

實驗室常用的熒光素酶有：

活體動物體內(nèi)可見光成像 In Vivo Optical Imaging

主要采用生物發(fā)光成像 (BLi,Bioluminescence imaging) 和（或）熒光成像 (Fluorescence imaging) 技術(shù)，對細(xì)胞、細(xì)菌、病毒、蛋白、抗體、核酸、小分子藥物分子和納米材料等進行標(biāo)記，并通過超高靈敏度相機采集產(chǎn)生的微弱信號，從而了解研究對象在體內(nèi)的生物學(xué)反應(yīng)和過程，實時觀察動物體內(nèi)腫瘤的生長及轉(zhuǎn)移、疾病發(fā)生發(fā)展過程、材料或藥物在體內(nèi)的代謝、基因表達等生物學(xué)過程。

IVIS （In Vivo Imaging Systems）

小動物活體光學(xué)成像系統(tǒng)，通過配備的高靈敏CCD相機、不透光成像室和全自動化的分析功能，具有高靈敏度生物發(fā)光和熒光成像性能，使我們能夠更全面地了解小動物模型體內(nèi)復(fù)雜的細(xì)胞活動和基因行為。

基于BLi的IVIS檢測優(yōu)勢

1.更靈敏

生物發(fā)光不需要激發(fā)光，特異性強，被組織吸收少，動物體內(nèi)無自發(fā)光，因此生物發(fā)光背景低、信噪比高，與熒光蛋白的熒光成像相比，生物發(fā)光成像體內(nèi)檢測更靈敏，可用于精確測量。

2.非侵入

采用非侵入式方法，實時連續(xù)動態(tài)檢測體內(nèi)的各種生物學(xué)過程，從而減少實驗動物數(shù)量，降低個體差異的影響，有利于長期觀察。

應(yīng)用領(lǐng)域

基因表達、蛋白質(zhì)間相互作用、癌癥研究、免疫學(xué)研究、干細(xì)胞研究、神經(jīng)疾病研究、藥物研發(fā)與藥效評估等等。

舉例

1.實時監(jiān)測腫瘤細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移

無論皮下荷瘤還是特定組織內(nèi)腫瘤，傳統(tǒng)的方法均無法在保證荷瘤小鼠存活的條件下檢測體內(nèi)原位或者轉(zhuǎn)移腫瘤；而利用IVIS可以長時間不同時間點、無創(chuàng)傷的定量檢測小鼠腫瘤。比如下圖：將熒光素酶標(biāo)記的結(jié)腸癌細(xì)胞株注射到裸鼠腦內(nèi)，利用IVIS可以在固定時間點觀察和統(tǒng)計腦內(nèi)腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移。

2.利用基因工程小鼠模型實時檢測炎癥相關(guān)因子表達變化

• IL1β-Luc 轉(zhuǎn)基因小鼠

通過顯微注射技術(shù)構(gòu)建的受人 IL-1β promoter 調(diào)控的 Luciferase 轉(zhuǎn)基因小鼠，在 LPS 注射刺激后的不同時間點分別進行背部以及腹部成像檢測，觀察小鼠整體熒光表達變化，并且能夠模擬內(nèi)源性 IL-1β 變化趨勢。

IL-1β轉(zhuǎn)基因小鼠在LPS刺激后不同時間點的雄性（Male）和雌性（Female）小鼠熒光表達變化（左圖）以及內(nèi)源性IL-1β相對表達定量結(jié)果（右圖）。

• Il1a-Luc 基因敲入小鼠

通過 CRISPR/Cas9 技術(shù)構(gòu)建內(nèi)源 Il1a-Luc 基因敲入小鼠模型，在 LPS 注射后不同時間點進行熒光成像檢測，可實時觀測內(nèi)源 Il1a 基因的表達強度變化。

參考文獻

1、Lim E., et al. In vivo bioluminescent imaging of mammary tumors using IVIS spectrum. J Vis Exp, 2009, (26)

2、Li L., et al. Functional imaging of interleukin 1 beta expression in inflammatory process using bioluminescence imaging in transgenic mice. BMC Immunol, 2008, 9:49

3、Mezzanotte L., et al. In Vivo Molecular Bioluminescence Imaging: New Tools and Applications. Trends Biotechnol. 2017 Jul;35(7):640-652.