隨著 PCR 酶的擴增效率越來越高，靈敏度日益精進，用微量甚至痕量的樣本就可以擴增出高濃度的產(chǎn)物。拍手鼓掌的同時，其實也增加了 PCR 過程中污染的風(fēng)險，即我們經(jīng)常說的假陽性的風(fēng)險。最常見的情況就是我們上周提到的 H2O 對照中也得出了陽性條帶。

要解決 PCR 污染的問題，我們就要從污染的原因入手分析。根據(jù)污染發(fā)生的不同實驗階段，大致有以下幾個污染高發(fā)點：

鼠尾取樣的時候

如果上一只小鼠的血液和體液殘留在剪刀上，就會將它的 DNA 帶到下一只小鼠的鼠尾上。這種情況如果用鼠尾直接 PCR 試劑盒做基因型鑒定的時候，假陽性的情況會更明顯。

解決方法

• 每一次剪鼠尾之前，都必須要用75%酒精擦拭清潔剪刀。或準(zhǔn)備兩把剪刀輪流使用，用完的剪刀浸泡在75%酒精溶液中。

• 還是推薦用裂解液和蛋白酶K處理鼠尾后將DNA純化之后做PCR鑒定，這樣可以將污染的概率降低。

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PCR體系中的引物、水和 PCR 酶或 buffer 等試劑中任何一管中混入 DNA 樣本都會造成污染。所以，每次實驗都要小心。

解決方法

• 配置 PCR 反應(yīng)體系的過程中槍頭要及時更換。

• 用完的試劑管要及時蓋上蓋子。

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很多童鞋說我都已經(jīng)把 PCR 反應(yīng)體系中的所有試劑都換成新的了，可還是污染？！其實，移液槍也是污染源之一。

解決方法:

• 移液槍外表面要經(jīng)常用75%酒精擦拭。

• 移液槍內(nèi)部的清潔比較困難。如果在前一次取樣的時候，操作不當(dāng)導(dǎo)致有少量的模板進入移液槍，那么在下一次實驗的時候很容易產(chǎn)生污染；還會污染整個 PCR 反應(yīng)體系。所以如果遇見這種情況，方法一：加樣的槍頭全部換成帶濾芯的槍頭，方法二：用一些商品化的分解基因組DNA的試劑處理一下移液槍。

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如果以上方法還是無法避免污染的問題，那么我們建議：

解決方法

• 更換配制 PCR 反應(yīng)體系的實驗室房間，或者去超凈臺里操作。
• 配制 PCR 反應(yīng)體系的實驗臺盡量和 PCR 儀以及電泳槽分開，因為 PCR 儀和電泳槽附近的區(qū)域往往是高濃度 DNA 彌散的區(qū)域。

跑電泳的時候

跑電泳過程中，上樣的槍頭是否更換呢？如果沒有更換，那么每次上完一個樣都要在電泳 buffer 中吹打清洗干凈。防止槍頭上帶有前一個樣品的產(chǎn)物，造成點樣的污染。

熒光定量 PCR

另外，在鑒定 Cre 和 Flp 這些轉(zhuǎn)基因小鼠的時候，可以嘗試通過熒光定量 PCR 做相對定量的方法來避免假陽性的問題。具體是指在熒光定量PCR的時候，同時鑒定目的基因和內(nèi)參基因，通過△Ct的方法來確定陽性產(chǎn)物，可以有效避免少量因為污染造成的假陽性問題。

南模生物可提供小鼠基因型鑒定服務(wù)