轉(zhuǎn)基因

重點(diǎn)：轉(zhuǎn)基因陽性小鼠與野生型小鼠交配 TG × WT

這里說的轉(zhuǎn)基因，并非廣義上的所有的基因修飾，而是特指外源基因隨機(jī)地整合到小鼠染色體上獲得的隨機(jī)插入轉(zhuǎn)基因小鼠。

通過受精卵顯微注射的方式，通常我們會(huì)獲得很多個(gè)帶有外源基因插入的首建鼠（Founder）。每一個(gè)首建鼠，外源基因插入的位置或次數(shù)都是不同的。所以每個(gè)首建鼠都應(yīng)該自成一系，也就是我們說的建系。

F1代中可能出現(xiàn)一窩小鼠沒有一只是陽性的情況。這是由于外源基因的整合可能發(fā)生在多細(xì)胞期，導(dǎo)致 Founder 小鼠中并不是所有細(xì)胞（包括生殖細(xì)胞）都有外源基因的整合，而是呈嵌合狀態(tài)。先別急著扔掉這個(gè) Founder 鼠，因?yàn)樗匀挥锌赡苁莻€(gè)陽性的 Founder，可以再試著多配幾窩。除非你的 Founder 鼠多到用不完... Lucky you！

還有幾點(diǎn)需要引起注意！

Founder 鼠之間不能相互交配。

通常轉(zhuǎn)基因小鼠的基因型鑒定方法只能判斷有無外源基因的整合（即陽性或陰性），并不能判斷某特定位點(diǎn)的純合或雜合。

陽性子代小鼠之間也不建議相互交配。

基因型陽性并不等于表達(dá)陽性，所以交配到F2代以上，還需要對(duì)每個(gè)系中的部分小鼠進(jìn)行外源基因表達(dá)的檢測(cè)，篩選到符合實(shí)驗(yàn)要求的轉(zhuǎn)基因系。

基因敲除/敲入

重點(diǎn)：雜合子與雜合子交配，獲得純合子+/- × +/- → -/-

對(duì)于采用 ES細(xì)胞打靶途徑獲得的基因敲除（KO）小鼠，在 Flp 重組酶去除 Neo 抗性基因以后，可以通過 KO 雜合子（+/-）之間相互交配的方式獲得1/4KO 純合子小鼠（-/-）、1/2 KO 雜合子小鼠（+/-）以及 1/4同窩野生型對(duì)照小鼠（WT）。繁育流程如下圖所示：

需要指出的是，對(duì)于利用 CRISPR/Cas9 介導(dǎo)的 NHEJ 途徑獲得的 KO 小鼠，情況有所不同，方案類似于轉(zhuǎn)基因小鼠的繁育。由于 NHEJ DNA修復(fù)的結(jié)果是隨機(jī)發(fā)生的，所以每一只 KO Founder 小鼠、甚至一只 Founder 中每個(gè)細(xì)胞的基因型都可能是不同的。因此，KO Founder 要與野生型小鼠（比如：C57BL/6J）交配，獲得基因型明確的 F1子代 KO 雜合子（+/-）小鼠。隨后，才能進(jìn)行雜合子小鼠的相互交配。

不同的 KO Founder 之間不能相互交配。

不同的 KO Founder 的子代之間也不建議相互交配。

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條件性基因敲除

重點(diǎn)：獲得 flox 純合同時(shí) Cre 陽性的小鼠（f/f；Cre-）× （f/+；Cre+） → f/f；Cre+

Flox 小鼠在去除 Neo 基因以后（CRISPR/Cas9 途徑獲得的 CKO 小鼠省略此步驟），獲得僅含有兩個(gè) loxP 位點(diǎn)的 flox 雜合子小鼠（flox/+，可縮寫成 f/+）。 flox 雜合子（f/+）小鼠與組織特異性或誘導(dǎo)型 Cre 陽性（Cre+）小鼠交配，獲得 flox 雜合同時(shí)帶有 Cre （f/+；Cre+）的小鼠，再與 flox 雜合子（f/+）交配，這樣最終可以獲得1/8的 flox 純合且?guī)в?Cre 的條件性基因敲除小鼠（f/f；Cre+）。

在設(shè)計(jì)繁育路線、估算繁育規(guī)模的時(shí)候，有幾個(gè)系數(shù)會(huì)幫助你更順利地獲得足夠數(shù)量的實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組：