組織特異性 Cre 真的那么特異嗎？

師妹：師兄，應(yīng)該是肝臟特異表達(dá)的 Cre，怎么好像在腦里也有表達(dá)？

師兄：唉，理想是豐滿的，而現(xiàn)實(shí)往往是骨感的。其實(shí)，Cre 的非特異性表達(dá)是普遍存在的?。〈蟛糠?Cre 品系在其它組織中也有 Cre 活性。

由于 Cre 的非特異性表達(dá)導(dǎo)致基因敲除的脫靶，有可能在你不自知的時(shí)候直接影響到你的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。

比如，受神經(jīng)元特異性 Emx1（empty spiracles homolog 1）啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的 Cre 小鼠，除了在新皮質(zhì)和海馬中高表達(dá) Cre 以外，在腎臟和胸腺中也會(huì)表達(dá) Cre。

師兄：如果 Cre 的脫靶發(fā)生在生殖細(xì)胞里，那就有可能直接得到全身性敲除小鼠了。還是以 Emx1-Cre 為例，研究發(fā)現(xiàn)在一小部分生殖細(xì)胞中也有 Cre 表達(dá)，并且雄性與雌性都可能出現(xiàn)這樣的脫靶。

師妹：那我怎么知道有沒有發(fā)生生殖系脫靶呢？

師兄：我們可以通過 PCR 方法發(fā)現(xiàn)是否發(fā)生了全身敲除。只需要在 flox 區(qū)域的上下游分別設(shè)計(jì)一條上游引物和一條下游引物（下圖橙色箭頭）。

如果發(fā)生了全身敲除，那么在做基因型鑒定 PCR 時(shí)，會(huì)出現(xiàn)一條最短的條帶。將帶有這條短帶的小鼠移除即可。

我用的 GFAP-Cre 和你用的 GFAP-Cre 不一樣？

師妹：我和文獻(xiàn)里用的明明都是 GFAP-Cre，為什么表型差別這么大？

師兄：看看你買的 GFAP-Cre 全名叫啥？從哪來的？不同機(jī)構(gòu)構(gòu)建的 Cre 品系，Cre 的表達(dá)譜都不一樣！

雖然 Cre 都受 glial fibrillary acidic protein promoter 驅(qū)動(dòng)，但 Tg(GFAP-cre)8 Gtm 主要在星形膠質(zhì)細(xì)胞中表達(dá) Cre；而 Tg(GFAP-cre)25Mes 除了在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的星形膠質(zhì)細(xì)胞、少突神經(jīng)膠質(zhì)、室管膜以及一些神經(jīng)元中表達(dá) Cre，還在心內(nèi)膜、肺血管內(nèi)皮細(xì)胞、肝臟門靜脈周細(xì)胞、附睪管中有 Cre 表達(dá)。這差別可不是一點(diǎn)半點(diǎn)呢。

師妹：看來購買 Cre 工具鼠可得小心謹(jǐn)慎。

師兄：是啊，所以說前期的文獻(xiàn)工作很重要呢！

通過已發(fā)表的文獻(xiàn)，可以知道主要在哪些組織或細(xì)胞中表達(dá) Cre。

如果找不到 Cre 的相關(guān)文獻(xiàn)，那么保險(xiǎn)起見，還是將 Cre 小鼠與報(bào)告基因工具鼠交配一下，看看子代雙陽性小鼠里哪些組織有報(bào)告基因的表達(dá)，那么就可以大致判斷這種 Cre 小鼠是否合適了。

師妹：對了師兄，剛剛你那張表格是在哪里查到的？

師兄：是 MGI 的 Recombinase (cre) Activity 數(shù)據(jù)庫哦。

http://www.informatics.jax.org/home/recombinase

可以按你想要查詢的組織類型或特殊的啟動(dòng)子名稱來查詢相關(guān)的 Cre 工具鼠品系，很方便呢！

原來 Cre 鼠用雌鼠和用雄鼠還不一樣？

師妹：師兄，我應(yīng)該用雄性 Cre 配雌性 flox 小鼠還是用雌性 Cre 配雄性 flox 小鼠呢？

師兄：這個(gè)問題要看你使用的是哪種 Cre 啦，有的 Cre 小鼠父性遺傳與母性遺傳的重組效率有所差別哦。

比如 EIIa-Cre，來自母本的 Cre 在腎臟、肝臟、腸、胰腺中具有廣泛均勻的 Cre 活性，但在脾臟中呈馬賽克式的鑲嵌表達(dá)；而來自父本的 Cre 則都表現(xiàn)為鑲嵌式的重組活性。所以用雌性 Cre 來交配效率更高。

師兄：還有一些 Cre 品系在卵母細(xì)胞減數(shù)分裂后會(huì)有 Cre mRNA 或蛋白的持續(xù)存在，即使這個(gè)卵母細(xì)胞本身并不帶有 Cre 轉(zhuǎn)基因。這時(shí)，用雌性 Cre 小鼠與 flox 小鼠交配可以更快地直接獲得全身性基因敲除小鼠，比如：Ddx4-Cre 或 Sox2-Cre。

救命?。∥业?CKO 小鼠為什么基因還沒被敲除？

師妹：師兄，我的 Cre 到底有沒有起作用??？為什么基因還在表達(dá)？

師兄：先別急，再做一次基因型鑒定試試。確定是 Flox 純合子同時(shí) Cre 陽性嗎？

師妹：我已經(jīng) P 了 3 次了，錯(cuò)不了。

師兄：那你是怎么鑒定你要敲除的基因還在表達(dá)呢？

師妹：mRNA 水平都沒有變化…

師兄：RealtimePCR 引物設(shè)計(jì)在哪？我記得你敲除的是基因的 exon6 吧，如果你的一對引物都設(shè)計(jì)在 exon6 之前，那么 exon1-5 還是有可能被轉(zhuǎn)錄出來，表達(dá)量上就可能看不出差異了。

師妹：哦，我明白了，那我重新設(shè)計(jì)引物試試。一條引物放在被敲除的 exon6 上。

師兄：如果真的沒敲掉，說明你的 Cre 小鼠重組效率可能不容樂觀啊。你也許要考慮找個(gè)全身性敲除的小鼠來交配一下，用 KO/Flox 雜合子同時(shí) Cre 陽性的小鼠作為敲除組，這樣 Cre 只需要在一個(gè)等位基因上起作用就可以了，敲除效率可能會(huì)提高一些。

另外，其實(shí)不同基因的 flox 有的容易被 Cre 重組，有的則比較困難。這可能是由于染色體的狀態(tài)導(dǎo)致 Cre 酶比較難接近 loxp 位點(diǎn)的關(guān)系。

Cre 小鼠也會(huì)不育？

師妹：師兄，我用 flox 小鼠跟 Cre 小鼠交配了，但老是得不到實(shí)驗(yàn)組小鼠。我為了提高陽性小鼠的比例，還特意把 Cre 小鼠自交了呢。

師兄：你的 flox 基因和 Cre 不會(huì)是在同一條染色體上吧？

師妹：Flox 基因在 6 號染色體，Cre 我還真沒注意。

Cre 如果是隨機(jī)整合的，確實(shí)不好判斷整合在什么地方。有可能插入到某個(gè)基因里破壞了這個(gè)基因的功能，如果是純合子的話就可能有不育或者其它表型呢。

而且如果 Cre 活性過高可能引起在基因組中未知的 loxP 位點(diǎn)重組，從而引發(fā)敲除或異位，嚴(yán)重的會(huì)影響小鼠存活。

Cre 如果是 knockin 的，那從文獻(xiàn)或資料中就能知道整合在哪條染色體上了。

一般 Cre 還是用雜合子小鼠比較穩(wěn)妥。

廣泛表達(dá)的 Cre 在所有組織表達(dá)都一樣高？

師妹：為什么我用 CAG-CreER 小鼠在 Tamoxifen 誘導(dǎo)以后，有的組織敲除的好，有些組織不是那么理想呢？

師兄：你又真相了。哪怕是號稱全身廣泛表達(dá)的 Cre，在不同組織中還是會(huì)有所差異的。比如 CAG-CreER 在誘導(dǎo)后，在平滑肌、胰腺里表達(dá)要比在卵巢或脾臟中高。UBC-CreER 也有類似的情況。

誘導(dǎo)型 Cre 其實(shí)會(huì)漏？

師妹：為什么我還沒給 Tamoxifen ，就已經(jīng)能檢測到 KO 條帶了？

師兄：雖然理論上 Cre-ER 在沒有 Tamoxifen 誘導(dǎo)時(shí)應(yīng)該在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)，而無法進(jìn)入細(xì)胞核重組 loxp 位點(diǎn)。但實(shí)際上還有一些 Cre-ER 的小鼠即使在未誘導(dǎo)狀態(tài)，仍會(huì)發(fā)生不同程度的 DNA 重組，比如：Tg(Ins2-cre/Esr1)1Dam、Tg(Tyr-cre/ERT2)13Bos 等。

Reference

1. Gorski JA, Talley T, et al. Cortical excitatory neurons and glia, but not GABAergic neurons, are produced in the Emx1-expressing lineage. J Neurosci. 2002 Aug 1;22(15):6309-14.

2. Heffner CS, Herbert Pratt C, et al. Supporting conditional mouse mutagenesis with a comprehensive cre characterization resource. Nat Commun. 2012;3:1218.

3. Liu Y, Suckale J, et al. Tamoxifen-Independent Recombination in the RIP-CreER Mouse. PLoS One. 2010; 5(10): e13533.

4. Dankort D, Curley DP, et al. Braf(V600E) cooperates with Pten loss to induce metastatic melanoma. Nat Genet. 2009 May;41(5):544-52.

5. Vooijs M, Jonkers J, et al. A highly efficient ligand-regulated Cre recombinase mouse line shows that LoxP recombination is position dependent. EMBO Rep. 2001 Apr;2(4):292-7.