全身性基因敲除 or 條件性基因敲除

全身性基因敲除

也就是我們常說(shuō)的?KO（Knockout），也叫完全基因敲除，是指在小鼠所有組織細(xì)胞中，將靶基因的某些重要外顯子或功能結(jié)構(gòu)域、甚至所有外顯子敲除掉，導(dǎo)致靶基因的表達(dá)缺失。

應(yīng)用：

• 研究目的基因?qū)θ砩砘虿±淼墓δ?/li>

優(yōu)勢(shì)：

• 小鼠模型構(gòu)建周期短
• 交配流程簡(jiǎn)單

劣勢(shì)：

• 大約有1/3的基因純合敲除后會(huì)導(dǎo)致小鼠胚胎期死亡或出生期死亡
• 引發(fā)其它基因的代償，導(dǎo)致基因敲除后沒(méi)有明顯表型改變

條件性基因敲除

CKO（Conditional Knockout），將某個(gè)基因的修飾限制于小鼠某些特定類(lèi)型的細(xì)胞或發(fā)育的某一特定階段，實(shí)現(xiàn)對(duì)小鼠基因組的時(shí)空特異性修飾。

應(yīng)用：

• 胚胎致死性基因的研究
• 研究靶基因在特定組織或細(xì)胞中的功能
• 研究靶基因在特定時(shí)期或階段發(fā)揮的作用

優(yōu)勢(shì)：

• 多功能的基因敲除模型，可與不同工具鼠靈活搭配使用，客觀而系統(tǒng)地研究目的基因在不同組織器官發(fā)生、發(fā)育或疾病發(fā)生、治療過(guò)程中的作用與機(jī)制
• 克服了重要基因完全敲除后的胚胎致死或過(guò)早死亡

劣勢(shì)：

• 交配流程較為復(fù)雜
• 小鼠模型構(gòu)建周期相對(duì)較長(zhǎng)

CKO之于高分Paper

為什么說(shuō)擁有條件性基因敲除小鼠模型以后更容易發(fā)高分文章呢？

一篇好文章，意味著我們需要一個(gè)好故事。時(shí)間、地點(diǎn)、人物，這故事的三大基本要素自然是缺一不可！

簡(jiǎn)單的來(lái)說(shuō)，故事的主人公就是我們所研究的基因。而 CKO 除了可以明確目的基因的缺失在特定組織或細(xì)胞類(lèi)型之中發(fā)生，還可以限制發(fā)生的特定時(shí)間。

與普通的 KO 相比，CKO 無(wú)疑提供了更精準(zhǔn)確鑿的不在場(chǎng)證明。這樣的故事當(dāng)然也就更有說(shuō)服力，再也不怕 reviewer 質(zhì)疑啦！

關(guān)于CKO你一定要知道的"4W"

HOW CKO 是如何實(shí)現(xiàn)的？

條件性基因敲除的基本原理是重組酶系統(tǒng)（如：Cre-loxP）介導(dǎo)的位點(diǎn)特異性重組技術(shù)。

Cre-loxP 系統(tǒng)，是目前最常用的重組酶系統(tǒng)之一，它是來(lái)自于大腸桿菌噬菌體 P1 的重組酶系統(tǒng)。Cre 是重組酶（38kDa），可識(shí)別 34bp 長(zhǎng)的 DNA 序列 loxP。loxP 兩側(cè)各 13bp 構(gòu)成回文結(jié)構(gòu)，中間 8bp 為非回文結(jié)構(gòu)，因此 loxP 具有方向性。

• 當(dāng) DNA 分子上存在兩個(gè)同向 loxP 序列時(shí)，Cre 可將兩個(gè) loxP 序列之間的DNA 片段切出并環(huán)化，同時(shí)將 loxP 兩側(cè)的序列進(jìn)行連接。
• 當(dāng) DNA 分子上存在兩個(gè)方向相反的 loxP 序列時(shí)，Cre 可導(dǎo)致 loxP 之間的序列發(fā)生反轉(zhuǎn)。

WHAT CKO 敲除的是什么？

條件性基因敲除的靶基因中必須帶有可以被 Cre 重組酶識(shí)別的 loxP 序列，這種基因稱(chēng)為 floxed gene。

帶有 floxed 靶基因的小鼠稱(chēng)為 flox 小鼠。在這種小鼠中，通常采用 DNA 同源重組方法，在擬敲除基因片段的兩側(cè)分別放置一個(gè)同向的 loxP 位點(diǎn)。

loxP 位點(diǎn)的存在應(yīng)不影響該基因的功能。

WHERE & WHEN CKO 何時(shí)何地發(fā)生？

除了 flox 小鼠以外，重組酶系統(tǒng)介導(dǎo)的條件性基因敲除還需要另一類(lèi)重要的基因工程小鼠的參與——Cre 工具鼠。

Cre 工具鼠中，將 Cre 重組酶的編碼序列置于特定的基因啟動(dòng)子下，Cre 的表達(dá)特性決定了靶基因何時(shí)何地發(fā)生敲除。

Cre 在哪一種組織細(xì)胞中表達(dá)，靶基因的敲除就發(fā)生在哪種組織細(xì)胞；Cre 的表達(dá)水平將影響靶基因在此種組織細(xì)胞中進(jìn)行修飾的效率；使用誘導(dǎo)型Cre 重組酶可以通過(guò)給予誘導(dǎo)劑，決定在特定的發(fā)育時(shí)期或疾病發(fā)生階段，定時(shí)地進(jìn)行基因敲除。

影響 Cre 表達(dá) pattern 的的因素包括：

• Cre 上游的特異性啟動(dòng)子

廣泛型或組織特異性

• Cre 工具鼠的構(gòu)建方式

隨機(jī)整合或定點(diǎn)敲入

• Cre 的類(lèi)型

組成型或誘導(dǎo)型

實(shí)驗(yàn)時(shí)，將 flox 小鼠和 Cre 工具鼠進(jìn)行交配，最后獲得 flox 純合且 Cre 雜合的小鼠。在這類(lèi)小鼠中，凡是表達(dá) Cre 的細(xì)胞，兩個(gè) loxP 之間的序列被切除，從而實(shí)現(xiàn)組織特異性基因敲除。