小鼠基因組定點(diǎn)編輯技術(shù)

• ES細(xì)胞打靶技術(shù)

• CRISPR/Cas9技術(shù)

ES細(xì)胞打靶

在小鼠胚胎干細(xì)胞（ES 細(xì)胞）中進(jìn)行 DNA 同源重組，將 ES 細(xì)胞重新注射到囊胚腔中，可以形成嵌合胚胎，并能在假孕小鼠體內(nèi)發(fā)育，最終發(fā)育為嵌合體小鼠。這種嵌合小鼠的組織細(xì)胞（包括生殖細(xì)胞）可以分別來自囊胚的細(xì)胞和被注射的ES細(xì)胞。因此，通過嵌合小鼠和野生型小鼠的交配，ES 細(xì)胞中的遺傳信息就能夠傳遞到后代的小鼠個體中。

利用ES細(xì)胞打靶技術(shù)建立基因修飾小鼠模型的主要技術(shù)路線：

（1）構(gòu)建重組基因載體（正負(fù)雙向選擇系統(tǒng)）

（2）用電穿孔等方法把重組DNA轉(zhuǎn)入受體ES細(xì)胞內(nèi)

（3）用選擇培養(yǎng)基篩選抗藥ES細(xì)胞，并利用PCR或或 Southern blot 等方法鑒定發(fā)生正確同源重組的ES細(xì)胞

（4）將中靶ES細(xì)胞注射到受體囊胚中，將注射后存活的胚胎移植到假孕小鼠子宮中，讓其受孕，待小鼠出生后，通過觀察毛色的嵌合與否和嵌合程度判斷是否獲得嵌合體小鼠。

CRISPR/Cas9技術(shù)

CRISPR/Cas是細(xì)菌和古細(xì)菌在長期演化過程中形成的一種高度保守的適應(yīng)性免疫防御系統(tǒng)，可用來對抗入侵的病毒及外源DNA。

CRISPR是Clustered regularly interspaced short palindromic repeats（規(guī)律成簇間隔短回文重復(fù)）的縮寫。CRISPR簇是一個廣泛存在于細(xì)菌和古生菌基因組中的特殊DNA重復(fù)序列家族，其序列由一個前導(dǎo)區(qū)(Leader)、多個短而高度保守的重復(fù)序列區(qū)(Repeat)和多個間隔區(qū)(Spacer)組成。

Cas則是在CRISPR附近的一個多態(tài)性家族基因，這個家族基因編碼的蛋白均含有可與核酸發(fā)生作用的功能域，并且與CRISPR區(qū)域共同發(fā)揮作用，因此被命名為CRISPR關(guān)聯(lián)基因(CRISPR associated)，縮寫為Cas，包括Cas1～Cas10等多種類型。

當(dāng)細(xì)菌抵御噬菌體等外源DNA入侵時，在前導(dǎo)區(qū)的調(diào)控下，CRISPR被轉(zhuǎn)錄成pre-crRNA，然后被加工成一系列短的含有保守重復(fù)序列和間隔區(qū)的成熟crRNA，最終識別并結(jié)合到與其互補(bǔ)的外源DNA序列上發(fā)揮剪切作用。

利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)的這些特性，CRISPR/Cas9途徑獲得基因修飾小鼠模型的主要技術(shù)路線：

（1）我們可以針對基因組特定序列設(shè)計(jì)向?qū)NA（gRNA）

（2）體外轉(zhuǎn)錄gRNA以及編碼Cas9蛋白的mRNA

（3）將gRNA、Cas9 mRNA注射到小鼠受精卵中

（4）注射后的受精卵移植到假孕母鼠輸卵管中，受精卵發(fā)育成F0代小鼠。

擴(kuò)展閱讀——正負(fù)雙向選擇系統(tǒng) (positive-negative-selection, PNS)

由于高等真核細(xì)胞內(nèi)外源DNA與靶細(xì)胞DNA序列自然發(fā)生同源重組的機(jī)率非常低，約為百萬分之一，要把基因敲除成功的細(xì)胞篩選出來是一件非常困難的工作。因此，需要借助一些篩選標(biāo)記來解決這一關(guān)鍵問題。

“+” 正篩選標(biāo)記：通常是藥物抗性基因，最常用的就是Neo（新霉素抗性基因）。通過構(gòu)建打靶載體，將帶有目的片段的外源DNA序列連同正篩選基因 neo 通過 DNA 序列間的同源重組替代基因組中需要敲除或修飾的片段，達(dá)到敲除或敲入特定基因的目的。正篩選基因 neo的表達(dá)賦予重組 ES 細(xì)胞具有抵抗細(xì)胞毒性藥物 G418的特性，使細(xì)胞在藥物篩選下存活并形成細(xì)胞克隆。

“-” 負(fù)篩選標(biāo)記：為減少因隨機(jī)插入產(chǎn)生的藥物抗性克隆對篩選的干擾，可以在打靶載體同源重組區(qū)域的外側(cè)加上負(fù)篩選基因，通常是細(xì)胞毒性相關(guān)基因。例如來自皰疹病毒的胸腺嘧啶激酶(TK)基因，該基因可以將對細(xì)胞無毒的核苷類似物 Ganc 進(jìn)行磷酸化，從而產(chǎn)生對細(xì)胞有毒的核苷酸類似物。 當(dāng)打靶載體在細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行同源重組時，TK 基因由于在同源重組區(qū)域的外側(cè)，因此不會整合到細(xì)胞染色體上，隨著細(xì)胞的生長和分裂 TK 基因發(fā)生自然降解和稀釋，從細(xì)胞中消失。因此這類細(xì)胞不會因?yàn)?Ganc 的存在而死。但如果發(fā)生打靶載體隨機(jī)插入整合到 ES 細(xì)胞染色體上的情況，那么TK 基因很可能也會同時整合上去，結(jié)果導(dǎo)致這類非正確同源重組的ES細(xì)胞在 Ganc 的存在下生成有毒的核苷酸類似物而致死。