這些動物模型，為小核酸藥物再添一場東風(fēng)
經(jīng)過幾十年的發(fā)展，小核酸藥物終于逐步走向舞臺中央——2023年諾貝爾生理學(xué)或醫(yī)學(xué)獎肯定了核酸藥物的前景；2024年國產(chǎn)小核酸藥物的數(shù)起融資及收購在經(jīng)濟下行的當(dāng)下更顯耀眼。預(yù)計到2025年，小核酸藥物的市場規(guī)模將達到100億美元。
目前，全球范圍內(nèi)有近200個核酸藥物處于臨床試驗階段，主要用于治療肝部、眼部、皮膚、神經(jīng)系統(tǒng)疾病、腫瘤等領(lǐng)域。從所屬管線看，目前小核酸藥物研發(fā)的重點已經(jīng)從罕見病拓展至糖尿病、乙肝等慢性病領(lǐng)域，而國內(nèi)則基本直接跳過了罕見病小核酸藥物的開發(fā)，著重發(fā)力在糖尿病、降血脂等市場潛力巨大的病種上，比如瑞博生物和BI合作開發(fā)的關(guān)于治療非酒精性或代謝功能障礙相關(guān)脂肪性肝炎小核酸創(chuàng)新療法。
1 小核酸藥物簡介
小核酸藥物可以分為反義寡核苷酸（ASO）、小干擾RNA（siRNA）、miRNA、寡核苷酸適配子、CpG寡核苷酸等，它們的作用機制大都是相似的，通過與mRNA互補配對來發(fā)揮功能，而核酸適配體的作用機制則比較獨特，它們各自的具體機制如下：
miRNA藥物：
其機制是部分鏈的配對，與siRNA不同，miRNA只是在種子區(qū)的幾個堿基進行配對，所以miRNA可以調(diào)控多個分子。
RNAi藥物：
合成短雙鏈RNA，進入細胞后正義鏈被降解，反義鏈與多蛋白組分形成RISC復(fù)合體，RISC中保留的反義鏈與靶基因的mRNA特異地互補，同時RISC具有核酸酶活性，能將靶基因的mRNA切割降解或抑制其翻譯活性。
ASO藥物：
合成15-30nt的單鏈DNA或RNA，該序列進入細胞后與靶標mRNA結(jié)合，抑制mRNA翻譯或誘發(fā)mRNA降解。
核酸適配體：
核酸適配體是折疊成獨特的三維結(jié)構(gòu)的短單鏈寡核苷酸，利用其三維結(jié)構(gòu)特異性結(jié)合較大范圍的目標，包括蛋白質(zhì)、小分子、金屬離子、病毒、細菌和全細胞，其高特異性和結(jié)合親和力可達到抗體水平。與抗體相比，核酸適配體具有體外篩選快速、可無細胞化學(xué)合成以及體積小，具有較低免疫原性和較強組織穿透力等優(yōu)勢。
圖2.ASO和RNAi機制模式圖
2 小核酸藥物的遞送系統(tǒng)
小核酸藥物設(shè)計原理很簡單，但它們都需要被遞送到靶點細胞內(nèi)發(fā)揮作用，而且不能激發(fā)有害免疫反應(yīng)。遞送技術(shù)是小核酸藥物成敗的關(guān)鍵所在，也是一個專利壁壘遍布的領(lǐng)域，迄今為止，科學(xué)家們已經(jīng)開發(fā)出多種RNA遞送技術(shù)，它們可以分為2大類：一是化學(xué)修飾技術(shù)，通過改造核酸分子提高其穩(wěn)定性，并避免免疫系統(tǒng)的識別；二是遞送載體，遞送載體可以使核酸免受血清核酸酶活性和免疫成分的影響，而且可以決定藥物的生物分布[1]。
化學(xué)修飾技術(shù)
化學(xué)修飾技術(shù)主要應(yīng)用于分子量較小的RNA分子，它們包括siRNA、反義寡核苷酸（ASO）等。通過在特定位置進行化學(xué)修飾，提高這些小核酸分子的穩(wěn)定性、避免激發(fā)免疫系統(tǒng)反應(yīng)，并利用真核細胞中已有的酶來行使它們的功能。如GalNac(N-乙?；陌肴樘前?修飾，通過將GalNac以三價態(tài)的方式共價偶聯(lián)至核酸3’末端構(gòu)成，這是當(dāng)前小核酸藥物遞送最常用的系統(tǒng)之一。肝臟表面的受體CDR可以結(jié)合血液中的乳糖，并通過胞吞吸收，GalNac是與CDR結(jié)合能力最強的一種乳糖類似物，高度靶向肝細胞，遞送效率很高。
圖3.ASO, siRNA等小分子量RNA療法
基于脂質(zhì)的遞送系統(tǒng)
基于脂質(zhì)的遞送系統(tǒng)包括膠束（micelles），脂質(zhì)體（liposome）和脂質(zhì)納米顆粒（LNP），是使用最早也是當(dāng)前最成熟的遞送系統(tǒng)。RNA帶負電，帶正電的脂質(zhì)會和它結(jié)合，形成很小的反向交錯結(jié)構(gòu)的粒子，外面再包裹磷脂，形成的脂質(zhì)復(fù)合體可以將攜帶的RNA遞送到目的組織。由于肝臟是脂質(zhì)代謝的中心，這種遞送系統(tǒng)在肝臟上的應(yīng)用最為成熟，目前已有上萬種結(jié)構(gòu)迥異的脂質(zhì)遞送系統(tǒng)被創(chuàng)建出來，在小鼠模型中，現(xiàn)在向肝臟遞送的siRNA所需的劑量已經(jīng)可以做到比初代遞送系統(tǒng)低500多倍。
圖4.基于脂質(zhì)的RNA遞送系統(tǒng)
此外，改變LNP的脂質(zhì)組分或者添加新的脂質(zhì)分子，可以促進LNP遞送到肝臟以外的組織。Intellia Therapeutics和Beam Therapeutics公司都已經(jīng)分享了將mRNA遞送到造血干細胞和祖細胞中的LNP信息，它們帶來了開發(fā)靶向體內(nèi)造血干細胞療法的希望。
基于聚合物的納米顆粒
很多非病毒遞送系統(tǒng)可以使用聚合物和基于聚合物的納米顆粒，通過調(diào)節(jié)聚合物的極性、降解性和分子量，可以改變聚合物遞送RNA進入細胞的效率。比如，通過攜帶胺基讓聚合物呈陽性，提高聚合物與RNA分子的結(jié)合能力；通過讓聚合物分子攜帶可被生物降解的酯鍵，可以降低聚合物的細胞毒性。
圖5.基于聚合物的RNA遞送系統(tǒng)
還有一類可以用來遞送RNA的聚合物稱為樹枝狀大分子（dendrimers），它們以一個核心分子為中心，通過聚合反應(yīng)重復(fù)增長合成樹枝狀的聚合物，樹枝上修飾有陽離子基團，可以與帶負電RNA生成復(fù)合物。這種結(jié)構(gòu)可以將RNA遞送到中樞神經(jīng)系統(tǒng)，將siRNA遞送到肝臟內(nèi)皮細胞中，還能用于肌肉注射，并且這種樹枝狀大分子的結(jié)構(gòu)可不易被降解，可以增加給藥間隔。
圖6.適合在臨床環(huán)境下使用的遞送系統(tǒng)的特征
遞送系統(tǒng)是小核酸藥物開發(fā)的關(guān)鍵所在，一款成功的遞送系統(tǒng)通常需要具有以下特征：安全性高，可以在體內(nèi)生物降解；特異性高，脫靶率低；療效高，毒性低，重現(xiàn)性好等。
3 小核酸藥物研究相關(guān)動物模型
3.1心血管疾病
不同于罕見病的無藥可治，市面上通過降血脂改善心血管疾病癥狀的藥物并不少，但長期用藥容易引起患者內(nèi)心的抵觸，往往導(dǎo)致患者依從性低。小核酸藥物可以極大的降低給藥頻率，可以很好的解決這個問題。目前，有多個以不同血脂類型為靶點的小核酸藥物正在研發(fā)中，包括靶向PCSK9的小核酸藥物、靶向Lp(a)的小核酸藥物、靶向富含甘油三酯脂蛋白的小核酸藥物等[3]。
圖7.代謝紊亂類小核酸藥物主要靶點
PCSK9人源化小鼠模型
PCSK9可與低密度脂蛋白受體（LDLR）結(jié)合，并將LDLR轉(zhuǎn)移至溶酶體內(nèi)破壞，增加了LDLR的降解，進而促使循環(huán)中LDL-C水平升高[4]。2021年12月， PCSK9 siRNA藥物L(fēng)eqvio（inclisiran）獲FDA批準上市，實現(xiàn)一年兩針的用藥頻率，可持續(xù)有效降脂，是心血管領(lǐng)域的第一個小核酸藥物。南模生物自主研發(fā)了PCSK9人源化小鼠模型，可用于PCSK9靶向藥物的篩選及臨床前藥效驗證。
圖8.全人源化抗體evolocumab(PCSK9抑制劑)顯著改善PCSK9人源化小鼠血脂水平
LPA人源化小鼠模型
Lp（a）具有促動脈粥樣硬化、促炎和促血栓形成作用，被認為是心血管疾病的遺傳性、獨立因果風(fēng)險因素。目前尚無針對Lp（a）的獲批臨床藥物，靶向于Lp（a）的小核酸藥物將有望成為首個可有效降低Lp（a）的藥物。目前Olpasiran（AMG890和SLN360）對于降低Lp（a）的安全性及有效性的研究均在進行，初步結(jié)果均顯示具有較好的安全性及有效性，有望拔得頭籌。南模生物針對小核酸藥物研發(fā)需要，自主開發(fā)了多種LPA人源化小鼠，滿足客戶不同研發(fā)需求。
圖9.化合物單次給藥后檢測LPA血清蛋白水平及肝mRNA水平 (Data來自合作者）
ANGPTL3人源化小鼠模型
ANGPTL3是一種由肝臟合成的脂蛋白酯酶和內(nèi)皮酯酶抑制劑，抑制ANGPTL3被證實可降低血清低密度脂蛋白（LDL）、血清和肝臟甘油三酯水平，是心血管疾病的一個新治療靶點。Arrowhead公司的ARO-ANG3是一款靶向ANGPTL3的RNAi療法，被開發(fā)用于治療血脂異常、家族性高膽固醇血癥，已進入臨床III期。南模生物自主研發(fā)了ANGPTL3人源化小鼠模型，可用于相關(guān)藥物的開發(fā)。
圖10.hANGPTL3小鼠中hANGPTL3的表達水平
圖11.雄性hANGPTL3小鼠（n=3）中的血清血脂水平
3.2補體系統(tǒng)疾病
補體系統(tǒng)是先天免疫系統(tǒng)的一部分，主要功能是通過溶胞，吞噬及介導(dǎo)炎癥反應(yīng)來清除入侵的病原體。補體系統(tǒng)的各成分可根據(jù)不同的生物學(xué)功能分為3類：補體固有成分（C2、C3、C5等）、補體調(diào)節(jié)蛋白（CI抑制物、I因子、H因子）和補體受體（CR1、CR2、CR3、CR4、CR5、C3aR等）。補體失效或過度激活也會導(dǎo)致多種疾病，如缺血性中風(fēng)、膿毒癥等急性炎癥，牙周病、眼部疾病等慢性炎癥，紅斑狼瘡等自身免疫性疾病；此外，一些腫瘤、腎病、神經(jīng)退行性疾病、慢性溶血、血栓性微血管病等也與補體系統(tǒng)異常有關(guān)。
CFB人源化小鼠模型
圖12.在單次給藥試驗藥物（n=3）后，檢測第7天剩余的肝CFB mRNA（A）和血清蛋白水平（B） (Data來自合作者）
C3人源化小鼠模型
圖13.C3人源化純合子小鼠門靜脈區(qū)出現(xiàn)炎癥和膽管增生等癥狀
圖14.C3人源化純合子小鼠出現(xiàn)腎小球硬化、腎小球萎縮和毛細血管叢區(qū)域炎癥等癥狀
圖15.C3人源化純合子小鼠血生化檢測（n=5）
3.3中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病
由于血腦屏障（BBB）的存在，大部分治療中樞神經(jīng)系統(tǒng)藥物無法穿過BBB 在腦內(nèi)達到有效治療濃度。因此深入研究血腦屏障上物質(zhì)轉(zhuǎn)運體，對尋找治療中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病的新藥物作用靶點具有重要的意義。TFR1是一種單跨膜的細胞表面受體，主要通過結(jié)合轉(zhuǎn)鐵蛋白，將Fe離子轉(zhuǎn)運進入細胞內(nèi)，是細胞攝取鐵的主要途徑。通過將轉(zhuǎn)鐵蛋白與治療藥物、蛋白質(zhì)結(jié)合，可以讓TFR1成為向大腦定向運輸大分子藥物的“特洛伊木馬”，對阿爾茲海默癥、溶酶體貯積癥、腦癌等多種腦部疾病的治療都具有重要意義。
TFR1人源化小鼠模型
圖16.免疫熒光法檢測hTFR1小鼠內(nèi)皮細胞中hTFR1的表達
圖17.TFR1人源化小鼠中TFR1靶向治療劑的體內(nèi)評價。TFR1人源化小鼠通過i.v.注射用對照抗體（10mg/kg）和抗人TFR1的抗體（10mg/kg）。給藥后18小時后采集腦組織和血清并檢測。如圖所示，TFR1結(jié)合抗體顯示出較高的血清清除率和更高的腦暴露水平。(Data來自合作者）
3.4 ATTR相關(guān)疾病
轉(zhuǎn)甲狀腺素蛋白淀粉樣變性（ATTR）是由轉(zhuǎn)甲狀腺素蛋白（TTR）錯誤折疊導(dǎo)致其在組織中異常沉積所致的系統(tǒng)性疾病，受累臟器主要是周圍神經(jīng)和心臟[2]。Alnylam連續(xù)開發(fā)多個代際產(chǎn)品制霸ATTR這個患者人數(shù)眾多的疾病領(lǐng)域。Alnylam第一代ATTR產(chǎn)品Patisiran就是由LNP攜帶小核酸去靶向降解參與生成TTR蛋白的mRNA；LNP構(gòu)成決定了它主要靶向肝臟，容易引發(fā)過敏等不良反應(yīng)。后來，Alnylam開發(fā)了以GalNAc為代表的偶聯(lián)遞送系統(tǒng)，增強了小核酸藥物的靶向特異性，降低循環(huán)中的藥物清除，但也主要用于肝臟給藥，并且存在內(nèi)涵體逃逸問題。
TTR人源化小鼠模型
圖18.ELISA檢測TTR人源化小鼠中hTTR及mTTR的表達 (n=3)
4 展望
小核酸藥物相比現(xiàn)有小分子和抗體藥物具有藥物靶點篩選快、研發(fā)成功率高、不易產(chǎn)生耐藥性、更廣治療領(lǐng)域和長效性等優(yōu)點，并且有望從“源頭”解決疾病，具有較大發(fā)展?jié)摿?。目前小核酸藥物處境類?0年前的抗體藥物，仍然存在部分技術(shù)難關(guān)有待突破，包括肝臟以外組織的特異性遞送難題以及早期脫靶發(fā)現(xiàn)等問題。我國小核酸藥物研究起步較晚，目前LNP和GalNAc-siRNA綴合物技術(shù)的核心專利仍然掌握在國外企業(yè)手中，國內(nèi)企業(yè)需要獲得相關(guān)授權(quán)或從零起步開發(fā)自主技術(shù)平臺，因此需要奮起直追。
南模生物針對小核酸藥物研究的常見靶點自主研發(fā)了多種人源化動物模型，助力小核酸藥物的臨床前研究，模型信息詳見下表，歡迎咨詢。
Reference：
Paunovska et al., (2022). Drug delivery systems for RNA therapeutics. Nature Reviews Genetics, https://doi.org/10.1038/s41576-021-00439-4
JACC CardioOncol . 2021 Oct 19;3(4):488-505. doi: 10.1016/j.jaccao.2021.06.006. eCollection 2021 Oct.
Lipids Health Dis . 2022 Apr 23;21(1):41. doi: 10.1186/s12944-022-01649-3.
PCSK9 Inhibition With Monoclonal Antibodies: Modern Management of Hypercholesterolemia，doi/epdf/10.1002/jcph.766
Nat Rev Dis Primers . 2018 Jun 7;4:18035. doi: 10.1038/nrdp.2018.35.
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