圖2. 譜系追蹤策略^[3]

自 1990 年代初以來，基因重組技術(shù)一直用于細(xì)胞譜系追蹤，目前已經(jīng)成為了大多數(shù)譜系示蹤研究的首選方法。目前，體內(nèi)的遺傳細(xì)胞追蹤技術(shù)主要基于 Cre-loxP 、 Dre-rox 、 FLP-FRT 等同源重組系統(tǒng)，利用細(xì)胞或組織特異性表達(dá)的重組酶，特異性激活條件報(bào)告基因的表達(dá)，從而實(shí)現(xiàn)標(biāo)記細(xì)胞所有后代的永久遺傳標(biāo)記。

圖3.Cre-Loxp系統(tǒng)示意圖^[2]

小鼠的遺傳譜系追蹤最常使用的是Cre-loxP系統(tǒng)，而為實(shí)現(xiàn)重組的時(shí)間與空間的雙重控制，又進(jìn)一步開發(fā)了CreERT2-loxP系統(tǒng)，可使用他莫昔芬進(jìn)行誘導(dǎo)重組，從時(shí)間上調(diào)控介導(dǎo)Cre-loxp重組。這種方法也被稱為誘導(dǎo)性Cre重組酶。

圖4.CreERT2示意圖^[2]

根據(jù)重組類型和數(shù)量，基因重組系統(tǒng)可以分為傳統(tǒng)的單重組酶介導(dǎo)的遺傳方法與更復(fù)雜的多重組酶介導(dǎo)的遺傳方法。

根據(jù)細(xì)胞標(biāo)記所需的熒光報(bào)告基因數(shù)量，單重組酶類型可進(jìn)一步分為單色報(bào)告基因和多色報(bào)告基因。常用的報(bào)告基因包括Rosa26-tdTomato、Rosa26-LacZ、Rosa26-GFP 和 Rosa26-YFP等。

圖5.單重組酶介導(dǎo)的基因重組系統(tǒng)^[3]

單色報(bào)告基因就是最基礎(chǔ)的使用Cre-loxp系統(tǒng)進(jìn)行譜系示蹤，該技術(shù)的關(guān)鍵在于評(píng)估驅(qū)動(dòng)Cre的啟動(dòng)子的表達(dá)位置。而Cre-loxP系統(tǒng)的多色報(bào)告基因可用于單細(xì)胞標(biāo)記和克隆分析，為單細(xì)胞增殖、分化后的命運(yùn)提供了有價(jià)值的信息。這種報(bào)告系統(tǒng)也被稱之為“Brainbow”系統(tǒng)。

在 Brainbow 系統(tǒng)中，Cre/lox重組可在三種或更多熒光蛋白（XFP）之間隨機(jī)選擇表達(dá)，從而提供了一種區(qū)分相鄰神經(jīng)元和可視化其他細(xì)胞相互作用的方法。根據(jù)lox 位點(diǎn)不同還可以分為Brainbow-1 與Brainbow-2。

Brainbow-1 在成對(duì)不同的 lox 位點(diǎn)之間使用 Cre 介導(dǎo)的切除，實(shí)現(xiàn)不同的基因重組。Lox變體不會(huì)與經(jīng)典 loxP發(fā)生重組，但可以與相同的Lox變體發(fā)生重組。利用這一特性，Brainbow-1通過在同一結(jié)構(gòu)中交替使用變異 lox 位點(diǎn)和經(jīng)典 loxP位點(diǎn)，cre酶會(huì)在任意一對(duì)相同的lox位點(diǎn)之間進(jìn)行切除，同時(shí)去除另一對(duì)位點(diǎn)中的一個(gè)，從而防止進(jìn)一步的重組。

圖6.Brainbow-1：使用不相容的lox變體進(jìn)行隨機(jī)重組^[4]

在 Brainbow-2 中，Cre 以相反的方向反轉(zhuǎn)由 loxP 位點(diǎn)分隔的 DNA 片段以產(chǎn)生多個(gè)重組結(jié)果。當(dāng)兩個(gè)loxP為反向時(shí)，Cre 可以反轉(zhuǎn)中間的 DNA 片段。只要重組酶存在，倒轉(zhuǎn)就可以持續(xù)。而通過限制Cre酶的活性時(shí)間，就可以實(shí)現(xiàn)細(xì)胞中基因的穩(wěn)定重組。

圖7.Brainbow-2：利用 Cre 介導(dǎo)的反轉(zhuǎn)進(jìn)行隨機(jī)重組^[4]

使用 Brainbow系統(tǒng)對(duì)小鼠特定組織的單細(xì)胞進(jìn)行標(biāo)記后，即可根據(jù)顏色對(duì)終點(diǎn)細(xì)胞進(jìn)行分組，從而實(shí)現(xiàn)單細(xì)胞水平的譜系譜系示蹤。

如果沒有特定細(xì)胞類型特有的基因，則無法通過常規(guī)方法對(duì)其進(jìn)行特異性標(biāo)記。此外，在一個(gè)細(xì)胞群中靶向兩個(gè)基因啟動(dòng)子可能比依賴傳統(tǒng)報(bào)告系統(tǒng)中常用的單個(gè)啟動(dòng)子更精確。

控制由兩個(gè)啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的受限制報(bào)告基因表達(dá)需要兩種不同的重組酶系統(tǒng)，例如Cre-loxP、Flp-frt、Dre-rox 和 Nigri-nox等。目前已經(jīng)開發(fā)了多種雙重組酶介導(dǎo)的遺傳標(biāo)記系統(tǒng)，以增強(qiáng)特異性和同時(shí)標(biāo)記的細(xì)胞類型數(shù)量，目前常見的可分為交叉報(bào)告基因類型、獨(dú)家報(bào)告基因類型和嵌套報(bào)告基因類型。

圖8.多重組酶介導(dǎo)的基因重組系統(tǒng)^[3]

為了精確標(biāo)記一個(gè)細(xì)胞群，有時(shí)使用兩個(gè)細(xì)胞特異性maker來定義細(xì)胞群（如下圖A）。細(xì)胞特異性makerA與細(xì)胞特異性makerB雙陽性的細(xì)胞，才會(huì)被特異性標(biāo)記。

下圖中就是通過兩個(gè)細(xì)胞特異性標(biāo)記特異性標(biāo)記了細(xì)支氣管肺泡干細(xì)胞 （BASC）。BASC是位于細(xì)支氣管肺泡管交界處的多能干細(xì)胞，它們共同表達(dá)細(xì)支氣管細(xì)胞標(biāo)志物 Scgb1a1（也稱為 CC10）和肺泡2型細(xì)胞標(biāo)志物 Sftpc。由于缺乏專門定義BASCs的單一最佳標(biāo)記基因，無法使用傳統(tǒng)的Cre-loxP介導(dǎo)的譜系追蹤方法追逐B(yǎng)ASCs的分化命運(yùn)，而通過雙標(biāo)志物就可以特異性地追蹤Scgb1a1?+Sftpc+?BASC。

圖9.單色交叉報(bào)告基因系統(tǒng)^[3]

為了通過使用其他顏色同時(shí)對(duì)多種細(xì)胞類型（細(xì)胞群及其亞群）進(jìn)行遺傳標(biāo)記，交叉遺傳報(bào)告基因系統(tǒng)會(huì)結(jié)合兩個(gè)或多個(gè)報(bào)告基因。如下圖中，特異性makerA陽性的細(xì)胞會(huì)被標(biāo)記為紅色，特異性makerB陽性的細(xì)胞會(huì)被標(biāo)記成綠色，而makerA、B雙陽性的細(xì)胞由于同時(shí)表達(dá)紅色與綠色熒光而被標(biāo)記為黃色。這樣可以通過不同的顏色準(zhǔn)確區(qū)分不同來源的細(xì)胞，增強(qiáng)對(duì)細(xì)胞群命運(yùn)可塑性的理解。

圖10.多色交叉報(bào)告基因系統(tǒng)^[3]

通常，細(xì)胞類型中基因的激活不是“有”或“無”，特定的基因標(biāo)記意味著啟動(dòng)子的活性在這種細(xì)胞類型中相對(duì)較高，而在其他細(xì)胞中，目的啟動(dòng)子也可能被弱激活，這種現(xiàn)象也被叫做異位表達(dá)。異位表達(dá)對(duì)譜系追蹤的影響很大，常常會(huì)導(dǎo)致一些關(guān)于細(xì)胞命運(yùn)的爭(zhēng)議。

以 c-kit 基因?yàn)槔?，既往研究?bào)道 c-kit+細(xì)胞是心肌細(xì)胞祖細(xì)胞，可能有助于心臟損傷后的新心肌細(xì)胞生成。然而，隨后的研究表明，c-kit基因也在極少數(shù)心肌細(xì)胞中表達(dá)，表明心臟損傷后追蹤的心肌細(xì)胞可能是先前標(biāo)記的c-kit+心肌細(xì)胞。

想要明確這類問題，就可以使用獨(dú)家獨(dú)家報(bào)告基因系統(tǒng)。這類系統(tǒng)是利用兩個(gè)重組系統(tǒng)，將兩對(duì)識(shí)別位點(diǎn)錯(cuò)落的分布在兩個(gè)報(bào)告基因兩端。如果首先發(fā)生一個(gè)重組，則相應(yīng)報(bào)告基因的表達(dá)將去除另一個(gè)重組系統(tǒng)的一個(gè)識(shí)別位點(diǎn)。換句話說，這個(gè)系統(tǒng)會(huì)防止同一細(xì)胞中發(fā)生二次重組。

同樣以c-kit 基因?yàn)槔?，我們需要特異性靶向的c-kit+非心肌細(xì)胞，追蹤其分化命運(yùn)，才能得出正確的結(jié)論。因此，我們可以使用心肌細(xì)胞特異性標(biāo)記工具Tnni3-Dre將心肌細(xì)胞進(jìn)行標(biāo)記，之后再對(duì)c-kit+細(xì)胞進(jìn)行標(biāo)記，此時(shí)標(biāo)記的細(xì)胞即為c-kit+非心肌細(xì)胞。

圖11.獨(dú)家報(bào)告基因系統(tǒng)^[3]

在遺傳譜系追蹤實(shí)驗(yàn)的設(shè)計(jì)過程中，當(dāng)特定細(xì)胞類型的定義依賴于陽性和陰性標(biāo)記物（如A+B-細(xì)胞）時(shí)，只使用Cre-loxP 策略只能標(biāo)記所有 A 細(xì)胞，包括“想要的”細(xì)胞類型（如A+B-細(xì)胞）和“不需要的”細(xì)胞類型（如A+B+細(xì)胞）。在這種情況下，我們可以利用雙嵌套報(bào)告系統(tǒng)來精確區(qū)分這些不同的“想要的”和“不需要的”細(xì)胞類型。

以下圖為例，在使用 NR1 的方法中，啟動(dòng)子 A 介導(dǎo)的 Cre-loxP 內(nèi)部重組可能導(dǎo)致細(xì)胞 A 呈綠色。然而，如果啟動(dòng)子A在“不需要的”細(xì)胞B（A+B+細(xì)胞）中也被激活，由于B類型細(xì)胞中特定啟動(dòng)子B驅(qū)動(dòng)的外部Dre-rox重組已經(jīng)去除ZsGreen基因，因此這部分“不需要的”細(xì)胞B（A+B+細(xì)胞）仍呈現(xiàn)紅色。

這種方式較獨(dú)家報(bào)告基因系統(tǒng)的優(yōu)勢(shì)是Dre-rox 和 Cre-loxP 的重組順序不會(huì)影響最終結(jié)果，這是由 Cre 和 Dre 的表達(dá)決定的。因此，嵌套報(bào)告系統(tǒng)可用于破解一些定義具有已知陽性和陰性標(biāo)志物特異性表達(dá)的干細(xì)胞的細(xì)胞命運(yùn)。

圖12.嵌套報(bào)告基因系統(tǒng)^[3]

多重組酶介導(dǎo)的遺傳方法增強(qiáng)了細(xì)胞命運(yùn)圖譜的特異性和精確性，從而可以在生物過程中發(fā)現(xiàn)前所未有的細(xì)胞事件。策略的選擇主要取決于基因表達(dá)、可用的小鼠工具和要解決的科學(xué)問題。我們還可以結(jié)合實(shí)時(shí)成像更全面地觀察細(xì)胞行為。新的遺傳系統(tǒng)還可以與CRISPR-Cas9介導(dǎo)的條形碼相結(jié)合，為單細(xì)胞命運(yùn)研究提供更復(fù)雜但更高的分辨率。

圖13.單細(xì)胞譜系示蹤的新方法^[5]

南模生物深耕基因修飾動(dòng)物模型行業(yè)二十余年，致力于成為基因修飾模式生物行業(yè)的引領(lǐng)者，長(zhǎng)期關(guān)注譜系示蹤模型的新系統(tǒng)新技術(shù)，在譜系示蹤模型的構(gòu)建上擁有成熟的體系與豐富的經(jīng)驗(yàn)，上述講述的諸多模型均由南模生物構(gòu)建。

在重組酶小鼠方面，南模生物擁有龐大的Find Cre^?數(shù)據(jù)庫。該數(shù)據(jù)庫包含超過400多種自主產(chǎn)權(quán)Cre/Dre重組酶工具鼠供您挑選。

在報(bào)告基因小鼠方面，南模生物也擁有豐富的熒光蛋白工具鼠（光標(biāo)鼠^??），即在目的基因的特定位置引入報(bào)告基因（包括熒光蛋白，如EGFP、mYFP等）或標(biāo)記基因的小鼠模型，與特定重組酶工具鼠雜交，可以實(shí)現(xiàn)在特定細(xì)胞類群標(biāo)記出所需熒光，幫助蛋白標(biāo)記、譜系示蹤等實(shí)驗(yàn)順利進(jìn)行。

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