一文揭秘！綠色熒光蛋白的前世今生
說起綠色熒光蛋白（Green Fluorescent Protein，簡稱GFP），各位科研工作者一定不陌生。GFP是一種具有自發(fā)熒光的蛋白質(zhì)，現(xiàn)已被廣泛應(yīng)用于生物學(xué)研究、成像、分子生物學(xué)及生物醫(yī)學(xué)等多個(gè)領(lǐng)域。關(guān)于GFP的歷史最早可以追溯到1962年。
圖1 ??？ˋequorea Victoria）
GFP的發(fā)現(xiàn)
GFP最初來源于?？ˋequorea victoria）的組織，1988年由Osamu Shimomura研究團(tuán)隊(duì)首次發(fā)現(xiàn)并鑒定出來，隨后由Martin Chalfie和Roger Y. Tsien等科學(xué)家對(duì)其進(jìn)行了深入的研究。但GFP真正的“科研之路”卻是開啟于1994年2月11日出版的《Science》雜志。這一期的封面圖片展示了秀麗隱桿線蟲的綠色發(fā)光的感覺神經(jīng)元，一經(jīng)發(fā)表即被認(rèn)為是細(xì)胞生物學(xué)的一個(gè)重大突破。
圖2 ?Science雜志封面展示GFP修飾的秀麗隱桿線蟲
雖然這張圖對(duì)于見過了各種“花式”熒光標(biāo)記的各位科研工作者來說稀疏平常，但這卻是熒光蛋白應(yīng)用的開端。從此，GFP及其他后續(xù)發(fā)現(xiàn)的熒光蛋白，作為當(dāng)代生物科學(xué)中至關(guān)重要的工具之一，已輔助科學(xué)家發(fā)展出多種方法來觀察曾經(jīng)“不可見”的過程。
今天小編就其不同品類及應(yīng)用的角度，為大家介紹熒光蛋白的“起點(diǎn)”——GFP
GFP的結(jié)構(gòu)
GFP是一種直徑約為3.2納米的蛋白質(zhì)，由238個(gè)氨基酸殘基組成。熒光的產(chǎn)生主要就依賴于GFP蛋白質(zhì)內(nèi)部的三個(gè)氨基酸殘基（絲氨酸、天冬氨酸和酪氨酸）形成的花環(huán)結(jié)構(gòu)。當(dāng)紫外光（395-470nm）照射到GFP分子上時(shí)，花環(huán)結(jié)構(gòu)通過共軛共振的方式將紫外光能量轉(zhuǎn)化為綠色熒光。對(duì)GFP的激發(fā)光譜在395nm附近（紫外）和470nm附近（藍(lán)光）分別有一個(gè)主激發(fā)峰和一個(gè)次激發(fā)峰，而發(fā)射光譜在509nm附近（綠光）和540nm附近（側(cè)峰）分別有發(fā)射峰。值得注意的是，雖然450～490nm只是GFP的副吸收峰，但由于該激發(fā)光對(duì)細(xì)胞的傷害更小，因此通常多使用該波段光源（多為488nm）。
圖3 ?GFP的晶體結(jié)構(gòu)
GFP的變體
雖然GFP應(yīng)用廣泛，但仍然存在一些局限，如較低的亮度、熒光強(qiáng)度等。為了更好地進(jìn)行研究，科學(xué)家們還陸續(xù)研發(fā)出了多種GFP變體。這些變種熒光蛋白的熒光顏色、發(fā)射波長和熒光強(qiáng)度不同，可以應(yīng)用于多光子顯微鏡、熒光共振能量轉(zhuǎn)移（FRET）和熒光激活子（FACS）等技術(shù)中，進(jìn)一步拓展了GFP在生物學(xué)研究中的應(yīng)用范圍。
EGFP
應(yīng)用最為廣泛的紅移變體是1994年被發(fā)現(xiàn)的GFP單點(diǎn)突變體：GFP-S65T，其第65位由Ser突變?yōu)門hr。研究者發(fā)現(xiàn)，相比野生型，GFP-S65T的發(fā)光強(qiáng)度和光穩(wěn)定性都要好得多。另外相比野生型GFP在395nm和475nm的兩個(gè)主要的激發(fā)峰，GFP-S65T僅有一個(gè)在484nm的激發(fā)峰。GFP-S65T的發(fā)射波長也被保持在509nm，它的光譜特性幾乎符合經(jīng)典的FITC熒光特性（FITCex：496nm，F(xiàn)ITCem：520-530nm）。這種GFP突變體，因其熒光比野生型GFP亮很多倍，因此也被稱為增強(qiáng)型GFP，即EGFP。
圖4 ?EGFP的應(yīng)用
dEGFP
在應(yīng)用過程中，科學(xué)家們發(fā)現(xiàn)野生型GFP和EGFP以及其他多數(shù)突變體的半衰期較長，不適用于一些需要精確追蹤表達(dá)的減少和損耗的研究。因此，科學(xué)家在1998年構(gòu)建了另一種突變體：不穩(wěn)定增強(qiáng)型綠色熒光蛋白（dEGFP）。這種突變的原理是：小鼠的鳥氨酸脫羧酶（Ornithine decarboxylase, ODC）包含一個(gè)PEST序列，這個(gè)序列有促進(jìn)蛋白在細(xì)胞中降解的功能，這種突變的dEGFP就是將EGFP的cDNA序列融合到ODC基因的C-末端，使其可以被PEST降解，有利于實(shí)時(shí)追蹤基因表達(dá)動(dòng)力學(xué)的研究。
多彩熒光
在很多研究中，只有一種熒光顏色是不能滿足研究需求的，因此科學(xué)家們還研究了不同顏色的熒光蛋白。
黃色突變體：增強(qiáng)型黃色熒光蛋白EYFP，在使GFP的四個(gè)氨基酸發(fā)生突變后，EYFP的發(fā)射光變成黃綠色，且熒光亮度與EGFP相似。目前應(yīng)用廣泛的黃色熒光蛋白mCitrine和mVenus就是在EYFP基礎(chǔ)上改進(jìn)的突變體。
藍(lán)色突變體：增強(qiáng)型藍(lán)色熒光蛋白EBFP，在使GFP的四個(gè)氨基酸發(fā)生突變后，EBFP的激發(fā)波長為380nm，發(fā)射波長為440nm。由于EBFP發(fā)光較為微弱，因此針對(duì)其研發(fā)出了3個(gè)更亮的熒光突變體：Azurite、EBFP2和mTagBFP。
還有青色突變體：增強(qiáng)型青色熒光蛋白ECFP，在使GFP六個(gè)氨基酸發(fā)生突變后，ECFP的激發(fā)波長有433nm和453nm主次兩個(gè)激發(fā)峰，發(fā)射波長在475nm和510nm兩峰。
圖2 ?不同?？麄€(gè)體及其中純化的熒光蛋白
GFP的應(yīng)用
GFP化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定，可以耐受高溫、強(qiáng)酸和強(qiáng)堿等極端條件下的處理，適用于多種實(shí)驗(yàn)條件。GFP的熒光信號(hào)可以直接在活細(xì)胞或活體中觀察，無光漂白現(xiàn)象，熒光性質(zhì)不會(huì)被甲醛固定、石蠟包埋所影響。
在生物學(xué)研究中，GFP被廣泛應(yīng)用于基因表達(dá)、蛋白質(zhì)定位和相互作用、細(xì)胞追蹤和標(biāo)記、疾病模型研究等方面。通過將GFP融合到目標(biāo)蛋白的編碼基因上，可以實(shí)現(xiàn)對(duì)該蛋白的表達(dá)和定位的實(shí)時(shí)監(jiān)測。此外，通過改變GFP分子的結(jié)構(gòu)和染色體位置，還可以實(shí)現(xiàn)對(duì)蛋白質(zhì)相互作用、結(jié)構(gòu)和功能的研究。例如，研究人員可以將GFP標(biāo)記到特定細(xì)胞或組織中，觀察其在發(fā)育、疾病和治療過程中的動(dòng)態(tài)變化。
圖1 ?EGFP在小鼠不同組織中的表達(dá)（南模生物自研R26-CAG-EGFP，目錄號(hào)NM-KI-190090）
總之，綠色熒光蛋白（GFP）是一種具有自發(fā)熒光的蛋白質(zhì)，在生物學(xué)研究和生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中發(fā)揮著重要的作用。它的獨(dú)特性質(zhì)使其成為一種理想的標(biāo)記物和成像試劑，為我們深入了解生物過程和疾病機(jī)制提供了有力的工具。
About SMOC
南模生物自主研發(fā)多種熒光蛋白工具鼠，即在目的基因的特定位置引入報(bào)告基因（包括熒光蛋白，如EGFP、mYFP等）或標(biāo)記基因的小鼠模型（部分小鼠模型見下表），與特定重組酶工具鼠雜交，可以實(shí)現(xiàn)在特定細(xì)胞類群標(biāo)記出所需熒光，幫助蛋白標(biāo)記、譜系示蹤等實(shí)驗(yàn)順利進(jìn)行。如您有相關(guān)需求，歡迎撥打400-728-0660或者關(guān)注微信公眾號(hào)點(diǎn)擊在線咨詢，我們的專業(yè)團(tuán)隊(duì)將竭誠為您服務(wù)！
表1 部分熒光蛋白工具鼠
注：狀態(tài)以實(shí)際咨詢?yōu)闇?zhǔn)
參考文獻(xiàn)
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