百里挑一，這些疾病你選對模型了嗎？
生物領(lǐng)域的科學(xué)研究不可避免地涉及對疾病的深入探索。相比來講，選擇基因修飾小鼠模型進行疾病研究有許多優(yōu)勢。通過基因編輯技術(shù)，研究人員能夠精確模擬人類疾病中的特定基因變異，誘發(fā)相關(guān)表型，從而更好地理解這些變異對生理和病理過程的影響。
此外，小鼠和人類在生理結(jié)構(gòu)和器官系統(tǒng)相似度較高，能夠提供對人類疾病更真實的模擬。在繁育方面，小鼠是相對容易管理和操作的實驗動物，有著成熟的養(yǎng)殖、飼養(yǎng)、監(jiān)測和實驗技術(shù)。
總體而言，基因修飾小鼠為深入研究疾病提供了強有力的工具。那么在面對繁多的疾病類型時，我們應(yīng)該如何選擇適合自己研究的小鼠模型呢？
想要運用基因修飾動物模型進行疾病的體內(nèi)研究，會運用到這些要素：
一個目的基因(A)；
一個要研究的疾病(B)；
相應(yīng)的模型(C)；
基因在疾病模型中的表型(D)。
體內(nèi)研究的本質(zhì)實際上是通過對目的基因(A)的修飾，使動物模型(C)呈現(xiàn)出與人類疾病(B)相似的表型改變(D)。在這一過程中，基因是原因，疾病是宏觀結(jié)果，而表型則是具體的顯現(xiàn)形式。在研究過程中，模型的選擇是非常關(guān)鍵的一步。根據(jù)模型與其他兩個要素的關(guān)系，可以分為基因模型和疾病模型?？梢哉f，模型是重現(xiàn)整個過程的工具，也是整個研究的基石。
掌握了邏輯原理，現(xiàn)在如何去實踐選擇具體模型呢？下面來為大家介紹一些經(jīng)典模型案例。
1.代謝心血管疾病——肥胖：
代謝心血管疾病包括肥胖、糖尿病、心臟代謝紊亂、高脂血癥、動脈粥樣硬化、高血壓等，這類慢性病嚴重影響人的生活質(zhì)量，同時也帶來了沉重的經(jīng)濟負擔(dān)。以肥胖為例，肥胖癥是一種多因素疾病，其特征是體內(nèi)脂肪過多。肥胖癥在世界范圍內(nèi)的流行率都在增加，根據(jù)《中國居民營養(yǎng)與慢性病狀況報告（2020年）》的最新數(shù)據(jù)，目前中國成人中已有超過1/2的人超重或肥胖，成年居民（≥18歲）超重率為34.3%、肥胖率為16.4%。肥胖的遺傳學(xué)可分為綜合征型肥胖和非綜合征型肥胖。
圖1 肥胖的遺傳學(xué)：肥胖的綜合征和非綜合征形式
綜合征型肥胖有Prader-Willi、Fragile X、Bardet-Biedl、Cohen等，它們與發(fā)育遲緩和早發(fā)性肥胖有關(guān)。非綜合征性肥胖可能是單基因、多基因或染色體變異引起的。研究表明，LEP、LEPR、POMC、PCSK1、MC4R、BDNF等都是肥胖的致病基因。相比于多基因模型可以更好的模擬肥胖發(fā)生發(fā)展過程，單基因模型則適用于新治療靶點的后續(xù)驗證，例如廣為熟知的ob/ob和db/db小鼠、ZDF大鼠等。
南模生物利用基因編輯技術(shù)敲除瘦素基因Leptin構(gòu)建了Lep-KO小鼠（ob/ob小鼠）。該基因的敲除將導(dǎo)致嚴重的肥胖、肥胖引起的性腺功能不足，還與II型糖尿病的發(fā)展密切相關(guān)。可知Lep-KO小鼠是研究胰島素抵抗、肥胖、II型糖尿病等疾病的重要工具。
圖2 ?Lep-KO (ob/ob)小鼠的驗證。A,Lep-KO小鼠表現(xiàn)出明顯的肥胖表型（n=16）；B，Lep-KO 小鼠表現(xiàn)出高血糖的癥狀（n=16）；C-D，Lep-KO 小鼠表現(xiàn)出明顯的糖耐量異常（n=6，雄性，6周齡）；E，Lep-KO 小鼠的胰島素水平（n=4, 20周齡）
圖3 ?Lep-KO (ob/ob)小鼠皮下脂肪組織的H&E染色。結(jié)果顯示Lep-KO 小鼠脂肪細胞體積更大。
圖4 ?Lep-KO (ob/ob)小鼠胰腺的代表性圖片。結(jié)果提示Lep-KO 小鼠胰腺有炎性細胞浸潤。
2.原發(fā)腫瘤——肝癌、肺癌:
近年來，惡性腫瘤的發(fā)生率與死亡率逐年上升，成為威脅人類健康的主要因素之一。腫瘤的發(fā)生與原癌基因及抑癌基因功能的失調(diào)密切相關(guān)，可以說基因突變是癌變的分子基礎(chǔ)?；虻墓δ苎芯看呱嘶蛐揎椩l(fā)腫瘤小鼠模型的構(gòu)建。該模型的構(gòu)建是通過基因編輯技術(shù)使免疫健全小鼠的癌基因過表達或激活，抑癌基因敲除或抑制，使小鼠體內(nèi)自發(fā)形成腫瘤。這些模型完全保留了腫瘤的異質(zhì)性，更好地模擬了人類癌癥的發(fā)生和發(fā)展過程，對藥物反應(yīng)和耐藥性也具有很強的預(yù)測能力。
以肝癌為例，它是全球常見癌癥前六位。利用基因工程手段構(gòu)建的肝癌小鼠模型不僅能幫助科學(xué)家們在動物整體的組織器官水平上進行研究，還可以進一步探索細胞和分子水平的關(guān)鍵，為肝癌的發(fā)病機制、藥物篩選和臨床醫(yī)學(xué)研究提供了理想的實驗動物模型。這些基因修飾的原發(fā)肝癌小鼠模型因其全面的研究優(yōu)勢，受到研究者們的高度關(guān)注：
圖5 肝癌發(fā)生相關(guān)細胞通路
1.Pten肝特異性敲除小鼠：PTEN（Phosphatase and Tensin Homolog，磷酸酶與張力蛋白類似物），具有蛋白磷酸酶和脂質(zhì)磷酸酶的活性，主要通過拮抗PI3K/ATK信號通路調(diào)控多種生命過程。在一些高度惡性的腫瘤中常出現(xiàn)Pten的缺失。Pten全身性敲除的純合子小鼠常伴有胚胎致死，雜合子小鼠可發(fā)展出多器官腫瘤，在肝臟中特異性敲除Pten基因，可誘發(fā)脂肪細胞增殖，脂肪肝和肝纖維化等癥狀，這個模型再現(xiàn)了脂肪變性、脂肪性肝炎和肝癌的進展，可用于復(fù)制脂肪肝向肝癌轉(zhuǎn)化的進程。
2.Mir-122肝特異性敲除小鼠：鑒于miRNA可能是治療肝癌的潛在靶點，目前已建立了多種miRNA基因修飾的肝癌模型。MiR-122，全稱為MicroRNA-122，屬于miRNA。MiR-122通常被認為是肝癌的一種抑制因子，其異常表達已被證實與肝癌的發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān)。Mir-122全身性敲除小鼠在第5周開始出現(xiàn)炎癥，89%的雄性和23%的雌性小鼠在第10個月出現(xiàn)肝腫瘤。而Mir-122肝臟特異性敲除小鼠在第8～10周開始出現(xiàn)炎癥，50%的雄性和10%的雌性小鼠在第12個月出現(xiàn)肝腫瘤。這些研究結(jié)果強調(diào)了MiR-122在維持正常肝功能和抑制肝癌發(fā)展中的重要性。
3.Myc肝特異性過表達小鼠：c-Myc基因是Myc基因家族的一員，在許多腫瘤中存在著異常表達，其在細胞增殖、生長代謝、血管生成、細胞惡性轉(zhuǎn)化及凋亡中起著極為重要的調(diào)節(jié)作用。在肝臟中特異性的過表達Myc基因，該小鼠模型在2月齡時會自發(fā)肝癌。取小鼠的肝臟組織進行HE染色，可見細胞排列無序，胞核不清，空泡樣變性結(jié)構(gòu)，肝小葉結(jié)構(gòu)消失。進一步使用增殖標記物Ki67進行免疫熒光檢測，結(jié)果顯示相比對照組，實驗組小鼠肝組織的細胞分裂增殖活躍，符合腫瘤組織的特征。這表明該小鼠模型能夠模擬肝癌的病理過程，為腫瘤研究提供了有力的實驗基礎(chǔ)。南模生物自主研發(fā)了H11-CAG-LSL-Myc小鼠，可在與Cre工具鼠交配后，在Cre表達的組織中高表達Myc基因?？捎糜谀[瘤模型的建立與腫瘤研究中。
例如，與Alb-Cre小鼠交配后，可呈現(xiàn)以下表型：
圖6 肝部腫瘤小鼠與正常表型小鼠。左為H11-LSL-Myc；Alb-Cre小鼠，腹部膨隆，表面不平，腹腔內(nèi)可見明顯團塊狀物體充盈。右為Alb-Cre小鼠，腹部平坦，腹腔未見明顯腫脹等異常現(xiàn)象。
圖7 肝部腫瘤小鼠與正常表型小鼠肝臟組織學(xué)結(jié)果。#79小鼠的肝臟組織細胞排列無序，胞核不清，可見空泡樣變性結(jié)構(gòu)，肝小葉結(jié)構(gòu)消失，組織結(jié)構(gòu)呈不規(guī)則細胞團，符合腫瘤組織結(jié)構(gòu)特征。#88小鼠的肝臟組織肝細胞呈放射狀排列，細胞輪廓清晰，胞核圓形居中，肝小葉結(jié)構(gòu)清晰，組織結(jié)構(gòu)基本正常。
圖8 肝部腫瘤小鼠與正常表型小鼠肝臟Ki67表達結(jié)果。#79小鼠的肝臟組織有大量的Ki67陽性細胞，提示肝組織的細胞分裂增殖旺盛，符合腫瘤組織的特性。#88小鼠的肝臟組織有散在的Ki67陽性細胞，提示肝臟組織少量細胞有分裂增殖。
圖9 活體成像檢測荷瘤小鼠（野生型B6小鼠接種了H11-LSL-Myc; Rosa26-LSL-Luc-EGFP; Alb-Cre三陽性小鼠自發(fā)肝癌瘤塊）的luciferase的表達情況。隨著時間推移，熒光強度隨著腫瘤增大而逐漸增強。
肺癌也是特別常見的一種癌癥，近年更成為我國腫瘤發(fā)病率和死亡率最高的癌種。在肺癌患者中檢測出多種基因的突變， 研究者們利用發(fā)現(xiàn)的多種基因突變構(gòu)建了相應(yīng)的基因修飾小鼠模型，應(yīng)用較為廣泛的是與這兩個基因相關(guān)的模型：
圖10 肺癌中常見的基因突變
EGFR：EGFR突變肺癌模型：表皮生長因子受體(epidermal growth factor receptor，EGFR)在細胞增殖和分化中起到重要作用，是目前最重要的靶向治療靶點之一。突變后導(dǎo)致蛋白功能異常，持續(xù)處于激活狀態(tài)，導(dǎo)致腫瘤細胞的持續(xù)增殖。該基因的突變是非小細胞肺癌中最常見的突變，兩個突變，外顯子19的缺失和外顯子21的單個氨基酸替換L858R，通常被稱為“經(jīng)典的”表皮生長因子受體突變，加在一起占非小細胞肺癌觀察到的表皮生長因子受體突變的85%。EGFR-L858R突變引起的是類似于支氣管肺泡的彌漫性腫瘤，EGFR外顯子19的缺失則更多引起多灶性腺癌。
KRAS：KRAS基因是首個被確定的原癌基因，其編碼的基因是一種小的GTP水解酶，通過在激活（GTP結(jié)合）和失活（GDP結(jié)合）構(gòu)象之間循環(huán)來控制多個信號級聯(lián)通路，與HRAS、NRAS同屬于RAS超蛋白家族。正常的KRAS基因發(fā)揮抑癌作用，當(dāng)其發(fā)生異常時，持續(xù)處于激活狀態(tài)，導(dǎo)致腫瘤細胞的持續(xù)增殖，導(dǎo)致腫瘤發(fā)生。目前國際上還應(yīng)用較廣泛的肺癌動物模型是Kras-G12D小鼠模型，該模型從肺部炎性反應(yīng)到肺腺瘤進展時程較長，為肺癌病因的研究提供了更長的窗口期。南模生物自主研發(fā)了Kras-LSL-G12D小鼠，該小鼠與Cre小鼠交配后可獲得Kras-G12D點突變小鼠。
圖11 采用氣管內(nèi)注射的方法，將AAV-cre病毒注射到小鼠肺部，在肺細胞中表達Kras G12D致癌基因，從而誘發(fā)肺癌發(fā)生。3個月后對小鼠肺部進行CT檢測，CT結(jié)果顯示有明顯的腫瘤的形成。
圖12 ?Scgb1a1CreERT2/+; KrasG12D/+小鼠肺部CT檢測結(jié)果。小鼠經(jīng)腹腔注射玉米油/他莫西芬5次，5個月后對其肺部進行CT檢測。
圖13 ?Scgb1a1CreERT2/+; KrasG12D/+小鼠肺組織的H&E染色結(jié)果。肺部腫瘤均為肺腺癌，黑色箭頭指示腫瘤組織。Grade I和Grade IV ：動物腫瘤分級。
此外，我們還可以提供Kras(LSL-G12D/+)小鼠腫瘤細胞來源的荷瘤小鼠模型。腫瘤細胞可在受體小鼠體內(nèi)快速增殖。荷瘤小鼠模型可提高臨床藥效評價實驗操作的簡便性。
圖14 荷瘤小鼠體內(nèi)腫瘤細胞體積隨時間增長的變化
3.罕見病——血友病、DMD：
罕見?。≧are Disease），又稱孤兒?。∣rphan Disease），根據(jù)《中國罕見病定義研究報告2021》的規(guī)定，在新生兒發(fā)病率小于萬分之一、患病率小于萬分之一、患病人數(shù)小于14萬中只要符合一項標準的疾病，就被歸類為罕見病。盡管罕見病的發(fā)病率極低，但涵蓋的病種眾多，總體患者數(shù)量并不低。截至目前，全球已知罕見病超過7000種，患者約有3.5億人，是艾滋病和癌癥患者總數(shù)的兩倍多。其中，我國罕見病患者約2000萬人，每年新增患者超過20萬人。
研究表明，80%以上的罕見病由遺傳因素導(dǎo)致，50%在出生或兒童期發(fā)病，以先天性畸形、內(nèi)分泌代謝及神經(jīng)系統(tǒng)疾病為主。面對罕見病患者數(shù)量有限、研究樣本稀缺、臨床試驗難度較大的困境，合適的動物模型顯得尤為重要。建立和供應(yīng)穩(wěn)定可靠的罕見病動物模型對罕見病的發(fā)病機制研究、藥物靶點研究以及治療效果評價等方面都具有不可估計的潛力。
圖15 血友病相關(guān)基因治療歷史時間線
以血友病為例，作為一種血液性罕見病，血友病的特征是活性凝血活酶生成障礙，凝血時間延長。患者終身存在輕微創(chuàng)傷后出血的傾向，甚至在沒有明顯外傷的情況下也可發(fā)生“自發(fā)性”出血，嚴重時甚至危及生命。根據(jù)凝血因子的差異，血友病可分為由FVIII凝血因子功能異常引起的血友病A（hemophilia A，HA）與由FIX凝血因子異常引起的血友病B（hemophilia B，HB）。
在基因治療的研究中，動物模型的應(yīng)用是不可或缺的基礎(chǔ)支持條件。第一例血友病模型形成于上世紀七八十年代，隨著CRISPR-Cas9技術(shù)的發(fā)展與應(yīng)用，科研工作者對小鼠F9因子的第8外顯子核心功能區(qū)進行了定點編輯，成功獲得了小鼠血友病HB模型。2016年，成功構(gòu)建了攜帶點突變F9Y381D的小鼠，同時還制備了F9Y381S突變小鼠和第383位氨基酸突變?yōu)榻K止密碼子的敲除小鼠F9383STOP。同年，F(xiàn)8因子敲除即HA小鼠模型也得以成功構(gòu)建。
血液病小鼠模型的成功構(gòu)建極大的推動了血友病的研究。在此基礎(chǔ)上，南模生物自主研發(fā)了F8與F9基因敲除小鼠模型，可以表現(xiàn)出類似人類血友病的凝血時間更長的表型。
圖16 不同品系F8敲除小鼠活化部分凝血活酶時間（APTT）檢測。結(jié)果顯示F8-KO小鼠（NM-KO-00012）凝血所需時間明顯長于野生型小鼠
圖17 F9-KO(2)小鼠凝血指數(shù)的檢測。(A)活化部分凝血活素時間(APTT)測定顯示，F(xiàn)9-KO(2)小鼠的凝血時間明顯長于WT小鼠。(B)纖維蛋白原(FIB)檢測結(jié)果顯示，F(xiàn)9-KO(2)小鼠與WT小鼠FIB值無顯著差異。
不只是小鼠模型，南模生物還自主研發(fā)了F8-KO血友病大鼠模型，可以供研究者們進行F8因子缺失相關(guān)凝血機制研究和藥物試驗。
圖18 不同性別6w F8敲除大鼠活化部分凝血活酶時間（APTT）檢測。結(jié)果顯示F8-KO大鼠凝血所需時間明顯長于野生型大鼠。
圖19 不同性別6w F8敲除大鼠纖維蛋白原（FIB）檢測。結(jié)果顯示無顯著性差異。
再以罕見病杜興肌營養(yǎng)不良癥（DMD）為例，它是一種性聯(lián)隱性遺傳病，又名為假性肥大型肌肉萎縮癥，是癥狀最嚴重的肌肉萎縮癥。
肌肉細胞由于基因突變?nèi)毕?，無法正常產(chǎn)生一種稱為Dystrophin的蛋白質(zhì)，使鈣離子滲入細胞，引發(fā)瀑布反應(yīng)，導(dǎo)致患者全身肌肉無力；同時由于缺乏Dystrophin，細胞組織肌肉纖維變得無力且脆弱，經(jīng)長期的伸展后該缺失肌肉細胞組織將產(chǎn)生機械性傷害等等因素而破壞，最終導(dǎo)致肌肉細胞死亡。
南模生物構(gòu)建了Dmd基因突變小鼠模型Dmd-Q995X（MDX），發(fā)現(xiàn)該小鼠骨骼肌肌間隙變寬，肌纖維大小不一，細胞核聚集，炎性細胞浸潤，且抓力顯著降低，提示該模型可作為研究杜興肌營養(yǎng)不良癥的小鼠模型。
圖20 HE染色顯示MDX小鼠(雄性，6月齡)骨骼肌肌間隙變寬，肌纖維大小不一，細胞核聚集，炎性細胞浸潤
圖21 MDX小鼠的肢體抓力測試。通過握力計（BIO-G53，Bioseb，F(xiàn)rance）進行MDX小鼠肢體強度的評估。使MDX小鼠抓住拉桿然后輕輕向后拉，在失去抓地力之前施加到桿上的力被記錄為峰值阻力（g）。
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