譜系示蹤的難點——基因標(biāo)記的異位表達(dá)如何避免?(下)
通常,細(xì)胞或組織中的特異性 Marker 意味著啟動子的活性在這種細(xì)胞類型中相對較高,而并非在其他細(xì)胞中完全不表達(dá)。在其他細(xì)胞中,目的啟動子也可能被弱激活,這種現(xiàn)象也被叫做異位表達(dá)。異位表達(dá)對譜系追蹤的影響很大,常常會導(dǎo)致一些關(guān)于細(xì)胞命運的爭議。
圖. 異位表達(dá)對譜系示蹤的影響[1]
為了更精準(zhǔn)的標(biāo)記特定細(xì)胞類型,避免異位表達(dá)的影響,我們可以借助兩個(甚至以上)的 Marker 進(jìn)行標(biāo)記,那么在小鼠中利用多個 Marker 標(biāo)記時,我們就涉及到了使用多種重組酶與報告基因小鼠。
譜系示蹤系類課程往期回顧:
譜系示蹤的難點——基因標(biāo)記的異位表達(dá)如何避免?(上)?
譜系示蹤的難點——基因標(biāo)記的異位表達(dá)如何避免?(中)
前幾期,我們?yōu)榇蠹抑v述的幾種避免基因異位表達(dá)的系統(tǒng)均是針對報告基因小鼠進(jìn)行相應(yīng)改造,利用報告基因小鼠上的多對重組位點與報告基因的交錯排列來實現(xiàn)標(biāo)記不同細(xì)胞類型的目的。那么,是否存在針對重組酶設(shè)計的系統(tǒng)呢?
roxCre遺傳策略
roxCre 是將 rox-Stop-rox(RSR)插入 Cre 編碼區(qū)前或編碼區(qū)中,在移除 Stop 序列之前,Cre 無法正確進(jìn)行轉(zhuǎn)錄和翻譯。將該小鼠與另一個 Marker 基因啟動的 Dre 小鼠進(jìn)行交配后,Dre 介導(dǎo) RSR 之間發(fā)生重組將 Stop 序列去除后,該 Cre 才能正常發(fā)揮功能。
圖. roxCre 小鼠的兩種類型
有同學(xué)會提問,當(dāng) RSR 插入 Cre 編碼區(qū)時,即使通過 Dre-rox 重組去除 RSR 后,在其編碼序列中會包含一個剩余的 rox 位點,這個位點是否會影響 Cre 的重組效率呢?
中科院周斌團(tuán)隊對此進(jìn)行了相關(guān)研究,研究者在 Cre 的12個不同位點分別插入了 rox 序列,其中大部分位于螺旋結(jié)構(gòu)域之間。由于插入額外的 rox 氨基酸會改變 Cre 的原始序列,他們將這種包含剩余 rox 位點的 Cre 稱為 mCre。研究者通過通過用12個版本的 mCre(mCre1~mCre12)和響應(yīng)的GFP報告基因轉(zhuǎn)染細(xì)胞來篩選它們的重組效率。結(jié)果證明,mCre1、2、3、4、6、7、10和11的效率與傳統(tǒng)Cre相當(dāng)。說明通過合適的插入位點設(shè)計,包含 rox 位點的 Cre 與 普通 Cre 的重組效率可保持一致。
圖. 12種不同插入位點的mCre小鼠的重組效率檢測[2]
那么,這種 roxCre 遺傳策略如何幫助我們精確標(biāo)記細(xì)胞群呢?
若我們想標(biāo)記?A+B+?細(xì)胞,我們就可以利用啟動子 A 介導(dǎo)的 roxCre 小鼠、啟動子 B 驅(qū)動的 Dre 小鼠、以及 LSL-Reporter 小鼠進(jìn)行交配:
圖. roxCre 小鼠的基因重組圖解
A+B-?細(xì)胞或A-B+?細(xì)胞:
僅 makerA 表達(dá)時,Cre 由于RSR的存在而無法正確進(jìn)行轉(zhuǎn)錄和翻譯,該類型細(xì)胞無法被標(biāo)記。僅makerB 表達(dá)時,Dre 酶 無法重組 Loxp 位點,細(xì)胞無法被標(biāo)記。
A+B+?細(xì)胞:
makerB 介導(dǎo) Dre 表達(dá),Dre 酶會切除 roxCre 系統(tǒng)中兩個 Rox 位點之間的 stop 序列。makerA 可介導(dǎo) Cre 酶表達(dá),Cre 酶重組報告小鼠的 Loxp 位點,去除 LSL 中的Stop序列。因此,該類型細(xì)胞被 Reporter 基因標(biāo)記。
案例1
損傷后出現(xiàn)的過多的心肌成纖維細(xì)胞是組織纖維化的關(guān)鍵因素。經(jīng)前期研究,心肌成纖維細(xì)胞主要來源于心外膜與心內(nèi)膜。由于心內(nèi)膜細(xì)胞與心外膜細(xì)胞功能上的差異,研究者懷疑來自不同來源的成纖維細(xì)胞在心臟纖維化期間可能表現(xiàn)出不同的功能。為探索這一問題,研究者首先需準(zhǔn)確標(biāo)記不同來源的心肌成纖維細(xì)胞。
以心內(nèi)膜衍生成纖維細(xì)胞為例,研究者利用了心內(nèi)膜細(xì)胞marker?Col1a2?與成纖維細(xì)胞 marker?Nfatc1,構(gòu)建了以下小鼠:Nfatc1-Dre;Col1a2-RSR-CreER;R26-RL-GFP。
圖.?Nfatc1-Dre;Col1a2-RSR-CreER;R26-RL-GFP小鼠的基因重組圖解[3]
關(guān)于 Col1a2-RSR-CreER,激活 CreER 需要 Dre 和 TAM 兩者共同存在。因此,在 TAM 誘導(dǎo)下,該小鼠可以標(biāo)記 Col1a2 與 Nfatc1 雙陽性細(xì)胞,即心內(nèi)膜衍生成纖維細(xì)胞。
圖. 使用roxCreER準(zhǔn)確標(biāo)記心內(nèi)膜衍生成纖維細(xì)胞[3]
除上述通過加入 Stop 序列來調(diào)控 Cre 酶的活性的 roxCre 遺傳策略外,還有另一種思路,同樣也可以達(dá)到使用一種重組酶,調(diào)控另一種重組酶重組活性的策略。那就是?CrexER 遺傳策略。
CrexER 遺傳策略
CrexER 策略是通過將兩個 rox 位點插入到 CreER cDNA 的雌激素受體編碼區(qū)的兩側(cè),形成了可切換的 CreER 重組酶。由于 ER 的影響,在理想情況下,Cre-ER 蛋白是位于細(xì)胞質(zhì)的,無法入核發(fā)揮重組酶活性,而將該小鼠與另一個 Marker 基因啟動的 Dre 小鼠進(jìn)行交配后,Dre 介導(dǎo) RSR 之間的重組并將ER區(qū)去除,該 Cre 即可正常發(fā)揮功能。
圖. CrexER小鼠的基因重組圖解[4]
與前一套遺傳策略相似,CrexER 遺傳策略同樣適用于標(biāo)記 A+B+?細(xì)胞。
案例2
據(jù)報道,間皮細(xì)胞標(biāo)志物?Wt1?在發(fā)育中的冠狀動脈血管中表達(dá),但在其他血管中不表達(dá),并且Wt1-CreER 小鼠可標(biāo)記心外膜細(xì)胞與胚胎心臟中的冠狀動脈內(nèi)皮細(xì)胞。而第二個標(biāo)記物?Tie2?是泛內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)記物,在大多數(shù)血管以及某些髓系細(xì)胞群中表達(dá)。
研究者關(guān)注的是冠狀動脈內(nèi)皮細(xì)胞,因而他們構(gòu)建了以下的小鼠:Tie2-Dre;Wt1-CrexER;R26-LSL-tdTomato。
圖.?Tie2-Dre;Wt1-CrexER;R26-LSL-tdTomato?小鼠的基因重組圖解[4]
利用 CrexER 系統(tǒng),他們精準(zhǔn)標(biāo)記到了 Wt1 和 Tie2 的雙陽性的細(xì)胞群,經(jīng)過檢測,被標(biāo)記為紅色的細(xì)胞群中致密心肌中內(nèi)皮細(xì)胞占比 97.15%±0.61%。
圖. 使用 CrexER 準(zhǔn)確標(biāo)記心肌中內(nèi)皮細(xì)胞[4].
CDH3 為心肌內(nèi)皮細(xì)胞的另一 Marker。圖中紅色(CrexER 策略)與綠色(CDH3 標(biāo)記)信號基本一致。
上述講述的兩種對重組酶的改造方案,可標(biāo)記的細(xì)胞類型均為A+B+?細(xì)胞群。下面介紹一種可標(biāo)記A+B-?細(xì)胞的重組酶改造方式。
dCreER 遺傳策略
dCreER 策略是通過將兩個 rox 位點插入到 CreER 整體編碼區(qū)的兩側(cè),整段 CreER 均可以被 Dre 重組酶刪除。由于這樣的設(shè)計,因而導(dǎo)致當(dāng) Dre 酶不存在時,CreER 正常表達(dá)行使功能,當(dāng) Dre 酶存在時,CreER 序列被剪切,無法進(jìn)行表達(dá)或翻譯。
圖. dCreER 小鼠的基因重組圖解
如上圖所示,dCreER 遺傳策略適用于標(biāo)記 A+B-?細(xì)胞。
案例3
哺乳動物的脂肪組織有兩種不同類型:WAT 和 BAT。目前沒有很好的標(biāo)記 WAT 的 marker,主要方式還是依靠泛脂肪 marker PLIN1,而 BAT 可以使用棕色脂肪組織 marker?UCP1?進(jìn)行標(biāo)記。
因而研究者利用 dCreER 遺傳策略,構(gòu)建了?Plin1-dCreER;Ucp1-Dre;R26-tdTomato?小鼠(下述將?Plin1-dCreER;Ucp1-Dre?交配小鼠稱為 WA-iCre 小鼠)
圖.?WA-iCre;R26-tdTomato?小鼠的基因重組圖解[5]
在 WAT 中,PLIN1 正常表達(dá),UCP1 不表達(dá),因而在 TAM 的作用下,細(xì)胞被標(biāo)記為紅色;在 BAT 中,UCP1 表達(dá),進(jìn)而 Dre 介導(dǎo)兩個 Rox 位點發(fā)生重組,PLIN1 之后的 CreER 酶被去除,導(dǎo)致細(xì)胞無法被標(biāo)記上顏色。
圖. 使用 dCreER 準(zhǔn)確標(biāo)記 WAT 細(xì)胞[5]
以上是在譜系示蹤中對重組酶的幾種改造方案,經(jīng)過改造后,一種重組酶的活性可受到另一種重組酶的調(diào)控,這種制約關(guān)系可幫助我們精準(zhǔn)地標(biāo)記目的細(xì)胞。
關(guān)于譜系示蹤的各類工具介紹已經(jīng)講述完畢,雖然涉及的類型非常多,應(yīng)用也較為繁瑣,但可以幫助我們快速檢索目的細(xì)胞,明確細(xì)胞命運。最后一期,我們將對前面講述的的各類工具進(jìn)行一個梳理,并為您介紹這些工具相互連用的進(jìn)階案例,大家敬請期待~
上海南方模式生物科技股份有限公司(Shanghai Model Organisms Center, Inc.,簡稱"南模生物"),成立于2000年9月,是一家上交所科創(chuàng)板上市高科技生物公司(股票代碼:688265),始終以編輯基因、解碼生命為己任,專注于模式生物領(lǐng)域,打造了以基因修飾動物模型研發(fā)為核心,涵蓋多物種模型構(gòu)建、飼養(yǎng)繁育、表型分析、藥物臨床前評價等多個技術(shù)平臺,致力于為全球高校、科研院所、制藥企業(yè)等客戶提供全方位、一體化的基因修飾動物模型產(chǎn)品解決方案。
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