譜系示蹤的難點(diǎn)——基因標(biāo)記的異位表達(dá)如何避免？（中）

在遺傳譜系追蹤實(shí)驗(yàn)的設(shè)計(jì)過(guò)程中，基因的異位表達(dá)往往需要我們著重關(guān)注的問(wèn)題。目的啟動(dòng)子在非目的組織中的表達(dá)被稱為異位表達(dá)。為了更精準(zhǔn)的標(biāo)記特定細(xì)胞類型，避免異位表達(dá)的影響，我們可以借助兩個(gè)（甚至以上）的標(biāo)記物進(jìn)行標(biāo)記，這時(shí)標(biāo)記細(xì)胞就需要使用到多重組酶介導(dǎo)的遺傳方法。

圖. 異位表達(dá)對(duì)譜系示蹤的影響[1]

上一期，我們講述了雙重組酶介導(dǎo)的獨(dú)家報(bào)告基因類型，這種類型常用于標(biāo)記 A+B-（反之亦然）的細(xì)胞類型，這種標(biāo)記存在先后順序，相反的先后順序會(huì)極大的影響后續(xù)的標(biāo)記結(jié)果。而本次課程，我們來(lái)講述另一種常用的標(biāo)記A+B-的報(bào)告基因系統(tǒng)——嵌套報(bào)告基因系統(tǒng)。


譜系示蹤系類課程往期回顧：

【譜系示蹤系列第一期】基礎(chǔ)細(xì)胞標(biāo)記方式

【譜系示蹤系列第二期】單重組酶介導(dǎo)的多色報(bào)告系統(tǒng)方法

【譜系示蹤系列第三期】多重組酶介導(dǎo)的交叉報(bào)告基因方法

譜系示蹤的難點(diǎn)——基因標(biāo)記的異位表達(dá)如何避免？（上）?

嵌套報(bào)告基因系統(tǒng)


嵌套報(bào)告基因系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)是 Rosa26-CAG-site2-site1-Stop-site1-reporter A-site2-reporter B。這類系統(tǒng)是利用兩個(gè)重組系統(tǒng)，將一對(duì)識(shí)別位點(diǎn)放置于另一對(duì)識(shí)別位點(diǎn)與報(bào)告基因的兩端，形成一個(gè)重組系統(tǒng)包裹著另一個(gè)重組系統(tǒng)的嵌套結(jié)構(gòu)。如果內(nèi)部的重組系統(tǒng)發(fā)生重組后，外部的重組系統(tǒng)仍然可以發(fā)生第二次重組；但外部重組系統(tǒng)發(fā)生重組時(shí)，內(nèi)部的序列全部被切除，無(wú)法進(jìn)行再次重組。


以下圖為例，嵌套報(bào)告基因小鼠的基因重組為：

圖. 嵌套報(bào)告基因小鼠的基因重組圖解[1]

1

A+B-?細(xì)胞：

makerA 介導(dǎo) Cre 酶表達(dá)，Cre 酶會(huì)切除兩個(gè) loxP 位點(diǎn)之間的序列（第一個(gè) stop 序列被切除）。該系統(tǒng)按照啟動(dòng)子的方向，表達(dá)綠色熒光 ZsGreen。

2

A+B+?細(xì)胞：

makerB 介導(dǎo) Dre 酶表達(dá)，Dre 酶會(huì)切除兩個(gè) Rox 位點(diǎn)之間的序列（綠色熒光 ZsGreen、一對(duì)?Loxp 位點(diǎn)與全部的?stop 序列被切除），之后，該系統(tǒng)按照啟動(dòng)子的方向，表達(dá)紅色熒光 tdTomato。

3

A-B+?細(xì)胞：

makerB 介導(dǎo) Dre 酶表達(dá)，Dre 酶會(huì)切除兩個(gè) Rox 位點(diǎn)之間的序列（綠色熒光 ZsGreen、一對(duì)?Loxp 位點(diǎn)與全部的?stop 序列被切除），之后，該系統(tǒng)按照啟動(dòng)子的方向，表達(dá)紅色熒光 tdTomato。


因此，A+B-細(xì)胞被標(biāo)記為綠色。A-B+細(xì)胞、A+B+細(xì)胞被標(biāo)記為紅色。


嵌套報(bào)告基因小鼠如何幫助我們避免基因標(biāo)記的異位表達(dá)呢？若我們想標(biāo)記 MarkerA 的細(xì)胞，啟動(dòng)子 A 介導(dǎo)的 Cre-loxP 內(nèi)部重組可能導(dǎo)致細(xì)胞 A 呈綠色。然而，如果啟動(dòng)子 A 在“不需要的”細(xì)胞 B（A+B+細(xì)胞）中也被激活，由于 B 類型細(xì)胞中特定啟動(dòng)子 B 驅(qū)動(dòng)的外部 Dre-rox 重組已經(jīng)去除 ZsGreen 基因，因此這部分“不需要的”細(xì)胞 B（A+B+細(xì)胞）仍呈現(xiàn)紅色。通過(guò)使用嵌套報(bào)告基因系統(tǒng)將異位表達(dá)的細(xì)胞標(biāo)記為其他顏色，從而排除 MarkerA 異位表達(dá)的影響。

案例1

Sox9+ 膽道上皮細(xì)胞是否在肝臟再生過(guò)程中形成肝細(xì)胞仍然存在爭(zhēng)議。一些譜系追蹤研究報(bào)告說(shuō)，Sox9-CreER 標(biāo)記的膽道上皮細(xì)胞（BEC）可能有助于體內(nèi)平衡和損傷后的肝細(xì)胞；其他研究報(bào)告說(shuō)，新產(chǎn)生的肝細(xì)胞來(lái)源于損傷后預(yù)先存在的肝細(xì)胞。值得注意的是，Sox9 在 BEC 和一些門脈周圍肝細(xì)胞中表達(dá)，這導(dǎo)致使用傳統(tǒng)的 Sox9-CreER 標(biāo)記不夠準(zhǔn)確，新的肝細(xì)胞可能來(lái)自Sox9-CreER 標(biāo)記的預(yù)先存在的肝細(xì)胞。

圖. 使用傳統(tǒng)的方法標(biāo)記 Sox9+?細(xì)胞無(wú)法準(zhǔn)確標(biāo)記 BECs[2]


因此利用肝細(xì)胞特異性標(biāo)記白蛋白 Alb-DreER與嵌套報(bào)告基因系統(tǒng)可區(qū)分Sox9+ BEC和Sox9+ 肝細(xì)胞。Sox9+ BEC被標(biāo)記為綠色，Sox9+ Alb+肝細(xì)胞被標(biāo)記為紅色，Alb+肝細(xì)胞也被標(biāo)記為紅色。至此，精確標(biāo)記的ZsGreen+ BEC和tdTomato+ 肝細(xì)胞可用于重新評(píng)估 Sox9+ BEC 在肝臟修復(fù)過(guò)程中對(duì)肝細(xì)胞的貢獻(xiàn)。針對(duì)肝損傷后的小鼠進(jìn)行熒光檢測(cè)分析表明，BEC 不會(huì)再生新的肝細(xì)胞，而只是在CCl4 誘導(dǎo)的肝損傷后增殖以補(bǔ)充 BEC。


圖. 嵌套報(bào)告基因系統(tǒng)準(zhǔn)確標(biāo)記 BECs[1]

因此，嵌套報(bào)告系統(tǒng)可用于破解一些定義具有已知陽(yáng)性和陰性 marker 的干細(xì)胞的細(xì)胞命運(yùn)。這種方式較獨(dú)家報(bào)告基因系統(tǒng)的優(yōu)勢(shì)是 Dre-rox 和 Cre-loxP 的重組順序不會(huì)影響最終結(jié)果，并且，嵌套報(bào)告基因系統(tǒng)更適合使用雙誘導(dǎo)型重組系統(tǒng)（例如 CreER 和 DreER）進(jìn)行細(xì)胞譜系示蹤。


那么，經(jīng)過(guò)兩期的學(xué)習(xí)，處理基因異位表達(dá)的兩套報(bào)告基因系統(tǒng)大家了解了嗎？，我們來(lái)再次復(fù)習(xí)一下：

嵌套報(bào)告基因系統(tǒng)

Nested reporter systems

  • 嵌套報(bào)告基因系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)是 Rosa26-CAG-site2-site1-Stop-site1-reporter A-site2-reporter B。

  • 嵌套報(bào)告系統(tǒng)可用于破解一些定義具有已知陽(yáng)性和陰性marker的干細(xì)胞的細(xì)胞命運(yùn)。

  • Dre-rox 和 Cre-loxP 的重組順序不會(huì)影響最終結(jié)果

  • 更適合使用雙誘導(dǎo)型重組系統(tǒng)


獨(dú)家報(bào)告基因系統(tǒng)

Exclusive reporter?systems

  • 獨(dú)家報(bào)告基因系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)是 Rosa26-CAG-site1-site2-Stop-site1-reporter A-Stop-site2-reporter B。

  • 獨(dú)家報(bào)告系統(tǒng)可用于破解一些定義具有已知陽(yáng)性和陰性marker的干細(xì)胞的細(xì)胞命運(yùn)。

  • 這種標(biāo)記存在先后順序，相反的先后順序會(huì)極大的影響后續(xù)的標(biāo)記結(jié)果。

  • 建議兩個(gè)重組酶中一種采用可誘導(dǎo)類型的重組酶，從而合理控制重組發(fā)生的先后順序。

那在實(shí)際設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)時(shí)，我們應(yīng)該如何選擇報(bào)告系統(tǒng)呢？

嵌套報(bào)告基因系統(tǒng)

VS

獨(dú)家報(bào)告基因系統(tǒng)

選擇哪種雙報(bào)告系統(tǒng)取決是否需要控制A&B的表達(dá)重組酶的時(shí)間，以及重組酶的類型選擇。


情況一



A&B不僅在目的組織中特異性表達(dá)，也在發(fā)育期/干細(xì)胞期廣泛表達(dá)。

在這種情況下，由于AB表達(dá)位置存在發(fā)育期表達(dá)的干擾，因而需控制A、B蛋白的表達(dá)時(shí)間，此時(shí)存在兩種情況：


a.?僅需控制單個(gè)marker的表達(dá)時(shí)間：

以marker A 需控制表達(dá)為例，由于marker A需調(diào)控表達(dá)時(shí)間，因而需使用A介導(dǎo)的可誘導(dǎo)的重組酶。此時(shí)，B介導(dǎo)的重組酶可以選擇可誘導(dǎo)的或者是組成型的（無(wú)需誘導(dǎo)）。如果選擇組成型的話，請(qǐng)確保A和B發(fā)生的重組順序正確，即可選擇獨(dú)家報(bào)告系統(tǒng)；如果選擇可誘導(dǎo)的，這時(shí)我們需選擇嵌套報(bào)告系統(tǒng)。


b.?需控制雙個(gè)marker的表達(dá)時(shí)間：

這種情況下，A與B都需要選擇可誘導(dǎo)的重組酶，這時(shí)我們需選擇嵌套報(bào)告系統(tǒng)。


情況二



A&B僅在目的組織中特異性表達(dá)，不會(huì)在發(fā)育期/干細(xì)胞期表達(dá)。

在這種情況下，無(wú)需調(diào)控A&B的表達(dá)時(shí)間，選擇哪種雙報(bào)告系統(tǒng)就取決于重組工具的類型，如果B介導(dǎo)的重組工具是組成型的，而A介導(dǎo)的重組工具是誘導(dǎo)型的，即可選擇獨(dú)家報(bào)告系統(tǒng)；如果A和B介導(dǎo)的重組都是可誘導(dǎo)的，即可選擇嵌套報(bào)告系統(tǒng)。

多重組酶介導(dǎo)的遺傳方法增強(qiáng)了細(xì)胞命運(yùn)圖譜的特異性和精確性，從而可以在生物過(guò)程中發(fā)現(xiàn)前所未有的細(xì)胞事件。策略的選擇主要取決于基因表達(dá)、可用的小鼠工具和要解決的科學(xué)問(wèn)題。在避免基因異位表達(dá)方面，我們不僅可以在報(bào)告小鼠方面做文章，我們還可以針對(duì)重組酶進(jìn)行設(shè)計(jì)。


下一期鼠博士為大家講解可用于避免基因異位表達(dá)的loxCre與roxCre報(bào)告系統(tǒng)。這一報(bào)告系統(tǒng)的神奇之處在于一種重組酶的活性受到另一種重組酶的調(diào)控，這種制約關(guān)系可幫助我們更精準(zhǔn)地標(biāo)記目的細(xì)胞。請(qǐng)大家敬請(qǐng)期待~


Reference：

[1] He L, Li Y, Li Y, Pu W, Huang X, Tian X, Wang Y, Zhang H, Liu Q, Zhang L, Zhao H, Tang J, Ji H, Cai D, Han Z, Han Z, Nie Y, Hu S, Wang QD, Sun R, Fei J, Wang F, Chen T, Yan Y, Huang H, Pu WT, Zhou B. Enhancing the precision of genetic lineage tracing using dual recombinases. Nat Med. 2017 Dec;23(12):1488-1498. doi: 10.1038/nm.4437. Epub 2017 Nov 13. PMID: 29131159; PMCID: PMC6913096.

[2] Liu K, Jin H, Zhou B. Genetic lineage tracing with multiple DNA recombinases: A user's guide for conducting more precise cell fate mapping studies. J Biol Chem. 2020 May 8;295(19):6413-6424. doi: 10.1074/jbc.REV120.011631. Epub 2020 Mar 25. PMID: 32213599; PMCID: PMC7212637.


上海南方模式生物科技股份有限公司（Shanghai Model Organisms Center, Inc.，簡(jiǎn)稱"南模生物"），成立于2000年9月，是一家上交所科創(chuàng)板上市高科技生物公司（股票代碼：688265），始終以編輯基因、解碼生命為己任，專注于模式生物領(lǐng)域，打造了以基因修飾動(dòng)物模型研發(fā)為核心，涵蓋多物種模型構(gòu)建、飼養(yǎng)繁育、表型分析、藥物臨床前評(píng)價(jià)等多個(gè)技術(shù)平臺(tái)，致力于為全球高校、科研院所、制藥企業(yè)等客戶提供全方位、一體化的基因修飾動(dòng)物模型產(chǎn)品解決方案。


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