譜系示蹤的難點——基因標(biāo)記的異位表達(dá)如何避免？（上）
通常，細(xì)胞類型中基因的激活不是“有”或“無”，特定的基因標(biāo)記意味著啟動子的活性在這種細(xì)胞類型中相對較高，而在其他細(xì)胞中，目的啟動子也可能被弱激活，這種現(xiàn)象也被叫做異位表達(dá)。異位表達(dá)對譜系追蹤的影響很大，常常會導(dǎo)致一些關(guān)于細(xì)胞命運的爭議。
圖.異位表達(dá)對譜系示蹤的影響[1]
上一期，我們講述了雙重組酶介導(dǎo)的交叉報告基因類型，這種類型常用于標(biāo)記雙陽性的細(xì)胞類型，而本次課程，我們來講述可以用于避免基因標(biāo)記異位表達(dá)的獨家報告基因系統(tǒng)。
譜系示蹤系類課程往期回顧：
【譜系示蹤系列第一期】基礎(chǔ)細(xì)胞標(biāo)記方式
【譜系示蹤系列第二期】單重組酶介導(dǎo)的多色報告系統(tǒng)方法
【譜系示蹤系列第三期】多重組酶介導(dǎo)的交叉報告基因方法
獨家報告基因系統(tǒng)
獨家報告基因系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)是 Promoter-site1-site2-Stop-site1-reporter A-Stop-site2-reporter B。這類系統(tǒng)是利用兩個重組系統(tǒng)，將兩對識別位點錯落的分布在兩個報告基因兩端。如果首先發(fā)生一個重組，則相應(yīng)報告基因的表達(dá)將去除另一個重組系統(tǒng)的一個識別位點。換句話說，這個系統(tǒng)會防止同一細(xì)胞中發(fā)生二次重組。
獨家報告基因小鼠的基因重組，存在先后順序，可能會出現(xiàn)以下兩種情況：
情況一
A-Cre 先表達(dá)，B-DreERT2 后續(xù)通過 Tamoxifen 誘導(dǎo)表達(dá)。
當(dāng)A-cre先表達(dá)時：
A+細(xì)胞：
makerA 介導(dǎo) Cre 酶表達(dá)，Cre 酶會切除兩個 loxP 位點之間的序列（第一個 stop 序列與第一個 Rox 位點被切除）。該系統(tǒng)按照啟動子的方向，表達(dá)綠色熒光 ZsGreen。
A-?細(xì)胞：
該系統(tǒng)未發(fā)生重組，按照啟動子的方向，遇到第一個 stop 序列被終止表達(dá)，細(xì)胞未被染色。
之后，使用 Tamoxifen 誘導(dǎo) B-DreERT2 時：
A+?細(xì)胞：
由于該系統(tǒng)中的第一個 Rox 位點被切除，無論細(xì)胞是否表達(dá)makerB，該系統(tǒng)均只表達(dá)綠色熒光 ZsGreen。
A-B+?細(xì)胞：
makerB 介導(dǎo) Dre 酶表達(dá)，Dre 酶會切除兩個 Rox 位點之間的序列（綠色熒光 ZsGreen、第二個 Loxp 位點與第二個 stop 序列被切除），之后，該系統(tǒng)按照啟動子的方向，表達(dá)紅色熒光 tdTomato。
A-B-?細(xì)胞：
該系統(tǒng)按照啟動子的方向，遇到 stop 序列被終止表達(dá)，細(xì)胞未被染色。
因此，A+細(xì)胞可被標(biāo)記為綠色。A-B+細(xì)胞可被標(biāo)記為紅色。
情況二
B-Dre 先表達(dá)，A-CreERT2 后續(xù)通過 Tamoxifen 誘導(dǎo)表達(dá)。
當(dāng)B-Dre先表達(dá)時：
B+細(xì)胞：
makerB 介導(dǎo) Dre 酶表達(dá)，Dre 酶會切除兩個 Rox 位點之間的序列（綠色熒光 ZsGreen、第二個 Loxp 位點與第二個 stop 序列被切除）。該系統(tǒng)按照啟動子的方向，表達(dá)紅色熒光 tdTomato。
B-?細(xì)胞：
該系統(tǒng)未發(fā)生重組，按照啟動子的方向，遇到第一個 stop 序列被終止表達(dá)，細(xì)胞未被染色。
之后，使用 Tamoxifen 誘導(dǎo) B-DreERT2 時：
B+?細(xì)胞：
由于該系統(tǒng)中的第一個 Loxp 位點被切除，無論細(xì)胞是否表達(dá)makerA，該系統(tǒng)均只表達(dá)紅色熒光 tdTomato。
A+B-?細(xì)胞：
makerA 介導(dǎo) Cre 酶表達(dá)，Cre 酶會切除兩個 loxP 位點之間的序列（第一個 stop 序列與第一個 Rox 位點被切除）。該系統(tǒng)按照啟動子的方向，表達(dá)綠色熒光 ZsGreen。
A-B-?細(xì)胞：
該系統(tǒng)按照啟動子的方向，遇到 stop 序列被終止表達(dá)，細(xì)胞未被染色。
因此，B+細(xì)胞可被標(biāo)記為紅色。A+B-細(xì)胞可被標(biāo)記為綠色。
我們使用獨家報告基因小鼠，如何避免基因標(biāo)記的異位表達(dá)呢？顯然，獨家報告基因小鼠可幫助您標(biāo)記 A+B-（反之亦然）的細(xì)胞類型，因此，若我們想標(biāo)記 MarkerA 的細(xì)胞，但 A 基因出現(xiàn)了異位表達(dá)，那我們可以利用在非目的細(xì)胞中特異性表達(dá)的 MarkerB，使用獨家報告基因系統(tǒng)將其標(biāo)記為其他顏色，從而排除 MarkerA 異位表達(dá)的影響。
案例1
以 c-kit 基因為例，既往研究報道 c-kit+細(xì)胞是心肌細(xì)胞祖細(xì)胞（ECs），可能有助于心臟損傷后的新心肌細(xì)胞生成。然而，隨后的研究表明，c-kit基因也在極少數(shù)心肌細(xì)胞中表達(dá)，表明心臟損傷后追蹤的心肌細(xì)胞可能是先前標(biāo)記的c-kit+心肌細(xì)胞。
但我們需要特異性靶向的c-kit+非心肌細(xì)胞，追蹤其分化命運，才能得出正確的結(jié)論。因此，我們可以使用心肌細(xì)胞特異性標(biāo)記工具Tnni3-Dre將心肌細(xì)胞進(jìn)行標(biāo)記，之后再對c-kit+細(xì)胞進(jìn)行標(biāo)記，此時標(biāo)記的細(xì)胞即為c-kit+非心肌細(xì)胞。
圖.獨家報告基因系統(tǒng)[2]
圖.使用普通方法標(biāo)記C-Kit+細(xì)胞無法準(zhǔn)確標(biāo)記ECs[2]
點擊下圖，觀看標(biāo)記圖示
上述講述的是多重組酶報告基因系統(tǒng)的獨家報告基因類型，主要用于標(biāo)記 A+B-（反之亦然）的細(xì)胞類型，這種標(biāo)記存在先后順序，相反的先后順序會極大的影響后續(xù)的標(biāo)記結(jié)果。為了更加合理的控制標(biāo)記細(xì)胞類型，建議兩個重組酶中一種采用可誘導(dǎo)類型的重組酶，從而合理控制重組發(fā)生的先后順序。
但如果您想標(biāo)記的細(xì)胞類型，他在胚胎發(fā)育期 markerA 表達(dá)，但在成年后 markerA 不表達(dá)，并且表達(dá)markerB。若我們采用獨家報告基因系統(tǒng)，使用A-Cre與B-DreERT2，目的細(xì)胞仍無法成功標(biāo)記。
是否存在可以使用兩個重組酶均是可誘導(dǎo)型的（可控制重組發(fā)生的時間），并且兩者之間的重組不會相互干擾，而且還可以成功標(biāo)記 A+B-?的細(xì)胞類型的報告工具鼠呢？
下一期鼠博士為大家講解多重組酶報告基因系統(tǒng)的嵌套報告基因類型。
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Cre-ERT2在無Tamoxifen誘導(dǎo)的情況下，在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)處于無活性狀態(tài)；當(dāng)Tamoxifen誘導(dǎo)后，Tamoxifen的代謝產(chǎn)物4-OHT（雌激素類似物）與ERT結(jié)合，可使Cre-ERT2進(jìn)核發(fā)揮Cre重組酶活性。
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