早期構(gòu)建Cre小鼠主要采用隨機轉(zhuǎn)基因技術(shù)。具體而言，是將帶有外源特異性啟動子的Cre基因序列隨機整合到小鼠基因組的某個位置。然而，采用這種方法得到的轉(zhuǎn)基因小鼠，其整合位點和基因拷貝數(shù)均不可控。由于整合位置的隨機性，Cre重組酶的表達可能會受到染色體狀態(tài)的干擾，例如，DNA甲基化等表觀遺傳修飾可能會導(dǎo)致Cre基因的沉默，進而影響Cre重組酶的正常表達。

因此，更為可靠的方法是通過基因打靶（ES細胞或CRISPR/Cas9途徑）的方式將單拷貝的Cre基因定點整合到內(nèi)源基因座中。主要有以下兩種：

（1）取代型表達Cre表達框直接插入到內(nèi)源基因起始密碼子前；

（2）共表達型的構(gòu)建方式是將Cre表達框通過2A（自剪切多肽）或IRES（內(nèi)部核糖體進入位點序列）元件敲入到小鼠內(nèi)源基因的3'端。

圖1. 取代型表達

圖2. 共表達

通常我們會利用Reporter小鼠與Cre小鼠雜交來驗證Cre的表達譜。Reporter小鼠一般是在Rosa26位點插入了帶有l(wèi)ox-stop-lox終止盒以及緊隨其后的報告基因。在沒有Cre酶存在的情況下，報告基因不會表達。當與Cre小鼠雜交后，Cre酶會識別并切除lox-stop-lox終止盒，使報告基因得以表達，通過觀察報告基因的表達情況，可推斷出Cre酶的活性及其作用范圍。

圖3. 共表達^[1]

通常，我們希望Cre重組酶僅在特定組織/細胞中發(fā)揮作用，但其意外表達（即“異位”表達）仍然可能發(fā)生，這可能導(dǎo)致非預(yù)期的重組事件發(fā)生。因此，在構(gòu)建Cre小鼠模型時，選擇高特異性的Marker基因至關(guān)重要。這些基因可以高效、精確地驅(qū)動Cre表達，從而降低漏表達或異位表達的風(fēng)險。應(yīng)盡量避免使用高表達但非特異的Marker基因，以減少實驗誤差。

在使用Reporter小鼠驗證組織特異性Cre小鼠時，常常會發(fā)現(xiàn)報告基因的表達比預(yù)期的更為廣泛。為確認是否發(fā)生了生殖系中的Cre意外表達，可通過將不同性別的子代小鼠（Cre/+; flox/+）分別與野生型小鼠交配，以獲得第二代子代。如果第二代小鼠的報告基因表達范圍顯著擴大，這表明很有可能發(fā)生了Cre的生殖系表達。因為Cre介導(dǎo)的重組可能發(fā)生在配子形成的二倍體階段，從而導(dǎo)致后代即使未攜帶Cre，仍表現(xiàn)出報告基因的表達。

若Cre小鼠發(fā)生生殖系表達，使用該Cre小鼠進行條件性基因打靶時，需謹慎選擇性別和交配方式。例如，母系遺傳的Cre小鼠品系應(yīng)使用雄性Cre陽性小鼠進行繁育，而父系遺傳的Cre小鼠品系則需使用雌性Cre陽性小鼠進行繁育。此外，誘導(dǎo)型Cre小鼠是一種有效的解決方案，通過僅在成年期或胚胎發(fā)育晚期激活Cre重組活性，可避免生殖系的意外表達，從而獲得更可靠的條件性基因打靶模型。

cKO小鼠通常需要把兩個等位基因全部刪除，才能達到基因敲除的目的，故其flox等位基因的基因型應(yīng)該為純合。一般情況下，Cre工具鼠一般是雜合子/半合子。（保證cre基因的拷貝數(shù)一致，避免重組效率不同導(dǎo)致實驗可重復(fù)性差；Cre小鼠的構(gòu)建方式為轉(zhuǎn)基因隨機插入或取代型敲入時，可能會破壞內(nèi)源基因的表達，使用雜合子/半合子在一定程度上可以避免該影響。）由此可見，cKO小鼠的目標基因型一般是cre/+；flox/flox。（本文中+代表wildtype）

圖4. 條件性敲除小鼠的繁育策略

首先，將Cre雜合子小鼠與flox雜合子或純合子小鼠交配，獲得的Cre與flox雙陽性（Cre/+; flox/+）子代小鼠。之后，再將Cre與flox雙陽性（Cre/+; flox/+）子代小鼠與flox雜合子或純合子小鼠交配，獲得所需的cre/+；flox/flox小鼠為實驗組。一般對照組為同窩+/+；flox/flox小鼠。