小鼠大學(xué)問 | Cre-Lox系統(tǒng)核心原理全解析

不論你是否直接進(jìn)行過基因操作，你一定聽說過Cre-lox系統(tǒng)。由于Cre-lox系統(tǒng)具有操作簡(jiǎn)單、重組率高的優(yōu)點(diǎn)，如今已經(jīng)成為體內(nèi)外遺傳操作的強(qiáng)有力工具。利用Cre-lox系統(tǒng)，可以在特定細(xì)胞、組織或整個(gè)生物體，甚至在特定時(shí)間點(diǎn)敲除或表達(dá)某個(gè)基因，實(shí)現(xiàn)對(duì)特定基因的時(shí)空特異性操作，這對(duì)基因功能的研究和人類疾病動(dòng)物模型的建立具有深刻影響。那你對(duì)該系統(tǒng)了解多少呢？小編給大家準(zhǔn)備了一系列的干貨知識(shí)講解，以供大家參考學(xué)習(xí)。本期給大家?guī)淼氖?/span>Cre-Lox系統(tǒng)的核心原理。


1.?什么是Cre-lox系統(tǒng)？


Cre-lox系統(tǒng)由Cre重組酶和loxp位點(diǎn)兩部分組成。



Cre重組酶

Cre重組酶由噬菌體P1的環(huán)化重組酶基因產(chǎn)生的一個(gè)38 kDa的DNA重組酶，能特異性地識(shí)別Loxp位點(diǎn)，實(shí)現(xiàn)DNA片段的重組。除Cre以外，此類重組酶還有Flp（flipase）和Dre（D6特異性重組酶）。



Lox位點(diǎn)

lox位點(diǎn)是一個(gè)34bp的序列，由兩個(gè)13bp的反向回文重復(fù)序列和8bp的中間間隔序列組成：ATAACTTCATGTA-NNNTANNN-TATACGAAGTTAT。N表示可變堿基，不同的堿基選擇可形成不同的Lox位點(diǎn)，除了野生型loxP，常見的還有Lox2272，Lox511，Lox5171等，這些突變Lox位點(diǎn)也能被Cre重組酶識(shí)別，但只有兩個(gè)序列相同的Lox位點(diǎn)之間才能發(fā)生重組。


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圖1 . loxP位點(diǎn)及其突變體位點(diǎn)[1]


根據(jù)lox位點(diǎn)的排列方向和位置，Cre重組酶能介導(dǎo)片段發(fā)生刪除、倒轉(zhuǎn)和易位三種重組事件：

  • Deletion（刪除）：當(dāng)兩個(gè)Lox位點(diǎn)在同一染色體上且方向相同時(shí)，兩個(gè)Lox位點(diǎn)之間的序列將被刪除。

  • Inversion（倒轉(zhuǎn)）：當(dāng)兩個(gè)Lox位點(diǎn)位于同一染色體上且方向相反時(shí)，兩個(gè)Lox位點(diǎn)之間的序列將發(fā)生序列倒轉(zhuǎn)。

  • Translocation（易位）：當(dāng)兩個(gè)Lox位點(diǎn)位于不同的染色體上且方向相同，將導(dǎo)致2條染色體上DNA片段的交換。


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圖2. Cre的重組機(jī)制[2]。A）loxP位點(diǎn)的基本結(jié)構(gòu)。紅色箭頭指示loxP位點(diǎn)的方向。B）Cre-loxP介導(dǎo)的易位重組。C）左圖示Cre介導(dǎo)兩同向loxP位點(diǎn)間的切除重組。右圖示Cre介導(dǎo)兩反向loxP位點(diǎn)間的反轉(zhuǎn)重組。


2.?體內(nèi)Cre-lox系統(tǒng)的基礎(chǔ)應(yīng)用


利用Cre-lox系統(tǒng)在小鼠體內(nèi)實(shí)現(xiàn)對(duì)基因的時(shí)空特異性打靶（表達(dá)或敲除），原則上需要建立兩種小鼠。

一是Cre工具鼠，該小鼠為攜帶Cre重組酶的基因修飾小鼠。其中，Cre重組酶由特定啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)，可在特定細(xì)胞或組織中表達(dá)；二是Flox小鼠，即在靶基因序列兩側(cè)插入Lox位點(diǎn)的基因修飾小鼠。通過將上述兩種小鼠交配繁育，即可獲得基因條件性敲除或過表達(dá)小鼠。



2.1 基因條件性表達(dá)

在基因條件性表達(dá)中，F(xiàn)lox小鼠的靶基因與啟動(dòng)子之間通常插入了一個(gè)“終止盒”（lox-stop-lox-GENE）。該元件能阻止靶基因的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)。將Flox小鼠與細(xì)胞類型特異性表達(dá)Cre的工具鼠交配所獲得的子代小鼠中，所有表達(dá)Cre重組酶的細(xì)胞，stop元件會(huì)被刪除。因此，靶基因僅在這些特定細(xì)胞中得以表達(dá)。

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圖3. 條件性基因表達(dá)小鼠原理示意圖[3]



2.2 基因條件性敲除

在基因條件性表達(dá)中，F(xiàn)lox小鼠一般在需要?jiǎng)h除的DNA片段兩側(cè)帶有同方向的兩個(gè)Lox位點(diǎn)（lox-GENE-lox）。將Flox小鼠與細(xì)胞類型特異性Cre小鼠交配所獲得的子代小鼠中，所有表達(dá)Cre重組酶的細(xì)胞，該DNA片段會(huì)被刪除。


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圖4. 條件性基因敲除小鼠原理示意圖[3]


3.?更精準(zhǔn)的誘導(dǎo)型Cre-lox系統(tǒng)


為更準(zhǔn)確地進(jìn)行遺傳功能研究，時(shí)間特異性的Cre-lox（也叫誘導(dǎo)型Cre-lox）被開發(fā)出來，可用于研究生物體發(fā)育過程特定階段的基因功能，或用來進(jìn)行譜系示蹤等。常用誘導(dǎo)型Cre-lox系統(tǒng)有：



3.1 CreER系統(tǒng)

通過他莫昔芬（Tam）誘導(dǎo)Cre酶的重組活性。在沒有他莫昔芬的情況下，CreER融合蛋白與熱休克蛋白90（HSP90）相互作用并存在于細(xì)胞質(zhì)中（圖5.1）。給予他莫昔芬藥物處理會(huì)破壞HSP90與CreER的相互作用（圖5.2）。ER與Tam的相互作用誘導(dǎo)Cre的核易位（圖5.3）。在細(xì)胞核中，CreER識(shí)別loxP位點(diǎn)（圖5.4）并使組織X中的基因Y失活（圖5.5）。CreERT2在體內(nèi)對(duì)藥物誘導(dǎo)的敏感性更高，因此一般優(yōu)選使用CreERT2。


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圖5. 他莫昔芬（Tam）誘導(dǎo)的Cre系統(tǒng)[4]



3.2 Cre;Tet系統(tǒng)

四環(huán)素誘導(dǎo)系統(tǒng)，也叫強(qiáng)力霉素（Dox，四環(huán)素衍生物）誘導(dǎo)的Cre系統(tǒng)。該系統(tǒng)有兩種模式：Tet-on和Tet-off，分別是Dox依賴性Cre的激活和Dox依賴性Cre的失活。Tet系統(tǒng)包括以下元件：反向四環(huán)素控制反式激活因子（rtTA）；四環(huán)素控制反式激活因子（tTA）；四環(huán)素響應(yīng)元件（TRE），通常是19個(gè)核苷酸的四環(huán)素操縱子（tetO）序列的7個(gè)重復(fù)，調(diào)節(jié)Cre基因的表達(dá)。Dox通常在小鼠的飼料或飲水中進(jìn)行給藥。


Cre;Tet-on系統(tǒng)：Dox給藥才能打開Cre表達(dá)。在Tet-on系統(tǒng)中，表達(dá)普遍存在的或組織特異性的啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的rtTA。在沒有Dox的情況下，失活的rtTA無法與負(fù)責(zé)調(diào)控Cre基因的TRE序列結(jié)合，則Cre不表達(dá)。在Dox給藥之后，Dox結(jié)合并激活rtTA。激活的rtTA與TRE序列結(jié)合并誘導(dǎo)Cre表達(dá)。


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圖6. Dox誘導(dǎo)的Cre;Tet-on系統(tǒng)[4]


Cre;Tet-off系統(tǒng)：Dox給藥后關(guān)閉Cre表達(dá)。在Tet-off系統(tǒng)中，在沒有Dox的情況下，激活的tTA能夠結(jié)合Cre前的TRE序列并誘導(dǎo)Cre表達(dá)。而在Dox給藥后，與Dox相互作用的tTA被滅活。滅活的rTA不再與TRE結(jié)合，因此Cre表達(dá)受到抑制。


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圖7. Dox誘導(dǎo)的Cre;Tet-off系統(tǒng)[4]


4.?南模生物Cre/Dre工具鼠庫(kù)

南模生物可提供超過600多種自主產(chǎn)權(quán)Cre/Dre工具鼠，覆蓋全身各類型的細(xì)胞組織，滿足科研人員多樣化的需求。同時(shí)，我們還在對(duì)Cre/Dre工具鼠進(jìn)行全面的驗(yàn)證，目前已經(jīng)完成了200多種Cre/Dre工具鼠的驗(yàn)證工作。

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為方便大家更快的找到自己想要的Cre工具鼠，我們還特別定制了Find Cre搜索系統(tǒng)：http://www.154v3.cn/findcre.html。Find Cre整個(gè)界面以小鼠組織、器官和系統(tǒng)為主線，可分為肺、肝、胃腸道、乳腺、胰腺、感覺器官、心血管系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)、神經(jīng)系統(tǒng)、泌尿生殖系統(tǒng)、骨骼肌系統(tǒng)以及其他組織器官。大家選擇自己感興趣的組織器官，就可以查看該組織下可用的Cre工具鼠啦，點(diǎn)擊這里即可快速訪問。


部分Cre品系驗(yàn)證數(shù)據(jù)如下：


1
Alb-CreERT2

Alb-CreERT2小鼠是研究肝臟基因功能與疾病的重要小鼠品系，驗(yàn)證數(shù)據(jù)證明Alb-CreERT2小鼠可以成為實(shí)現(xiàn)肝臟時(shí)間特異性敲除或表達(dá)的工具鼠。

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圖8. Alb-CreERT2; Rosa26-LacZ小鼠肝組織X-gal染色。未使用他莫昔芬誘導(dǎo)的小鼠，肝細(xì)胞未被染色；使用他莫昔芬誘導(dǎo)的小鼠，肝細(xì)胞成功著色。
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圖9. Alb-CreERT2; Rosa26-LacZ小鼠肝組織免疫熒光檢測(cè)。Alb-CreERT2; Rosa26-LacZ小鼠被他莫昔芬誘導(dǎo)后，LacZ（紅色）表達(dá)。

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圖10. Alb-CreERT2小鼠血生化檢測(cè)。結(jié)果顯示Alb-CreERT2小鼠與野生型小鼠相比肝功能正常。


2
Pvalb-Cre

Pvalb-Cre在中間神經(jīng)元中表達(dá)iCre重組酶，而不干擾內(nèi)源性Pvalb表達(dá)。這些小鼠可能對(duì)研究神經(jīng)元分化有重要作用。

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圖11. 熒光檢測(cè)PvalbCre+/-; Rosa26tdTomato+/-小鼠大腦皮層中間神經(jīng)元tdTomato的表達(dá)。


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圖12. 熒光檢測(cè)PvalbCre+/-; Rosa26tdTomato+/-小鼠海馬中間神經(jīng)元tdTomato的表達(dá)。結(jié)果顯示：雙陽(yáng)性小鼠海馬中間神經(jīng)元有tdTomato的表達(dá)，表達(dá)類型符合預(yù)期。


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下一期我們將深入探討Cre-lox系統(tǒng)的常見問題及飼養(yǎng)繁育技巧，感興趣的朋友可關(guān)注下方微信公眾號(hào)，即時(shí)獲取專業(yè)指導(dǎo)與實(shí)用干貨，加速您的研究進(jìn)程！



References
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