小技巧，大不同｜高度均一的移植瘤接種方法揭秘
小鼠腫瘤模型
自小鼠腫瘤模型的誕生已有一百多年的歷史，如今小鼠腫瘤模型在臨床前抗腫瘤藥物評價體系中發(fā)揮著重要的作用，為研究腫瘤發(fā)生與轉(zhuǎn)移的機(jī)制、篩選和評價抗腫瘤藥物的藥效提供了有力的工具。
小鼠腫瘤模型大致可分為自發(fā)性腫瘤小鼠模型、誘發(fā)性腫瘤小鼠模型、基因修飾小鼠腫瘤模型、異種移植瘤模型（PDX或CDX）、同種移植型小鼠腫瘤模型（CDA或MDA)等。其中，移植模型更易于和更廣泛用于臨床前藥效評價。
移植模型可分為細(xì)胞系移植和組織塊移植。我們今天主要關(guān)注的是使用率最高的皮下細(xì)胞系移植瘤模型。做過皮下移植瘤接種實(shí)驗的同學(xué)可能都遇到過，同時接種同等細(xì)胞量的小鼠長出的皮下瘤大小卻差異明顯，腫瘤不是過大就是過小，甚至形成串狀腫瘤或不成瘤，導(dǎo)致很難挑出均一的小鼠入組，進(jìn)行后續(xù)的藥效試驗。那么，如何獲得均一性良好的皮下荷瘤小鼠模型？
考慮到皮下移植的過程，我們可以從以下幾個方面入手：
細(xì)胞
成瘤實(shí)驗前，選擇合適的細(xì)胞株是非常重要的，即便是同一個癌種，不同細(xì)胞株的成瘤能力也可能天差地別。
例如乳腺癌細(xì)胞系JIMT-1增殖速度就遠(yuǎn)快于BT-474，因此建議大家先拿細(xì)胞株做個預(yù)實(shí)驗，以便正式實(shí)驗時合理安排實(shí)驗進(jìn)度。
Tips：對于生長速度較慢的腫瘤細(xì)胞可選用基質(zhì)膠，促進(jìn)腫瘤生長，通常加入30-50%的基質(zhì)膠。
不同乳腺癌細(xì)胞成瘤曲線
其次，細(xì)胞接種量和細(xì)胞狀態(tài)也是關(guān)鍵。接種細(xì)胞數(shù)量過少可能在老鼠皮下不能成瘤或成瘤后生長極慢，但接種量過多則可能引起腫瘤瘋長，出現(xiàn)這些情況并不利于實(shí)驗順利開展。細(xì)胞接種量一般通過查閱文獻(xiàn)確定或者做預(yù)實(shí)驗確認(rèn)，預(yù)實(shí)驗通常在5E5-1E7細(xì)胞量之間設(shè)置梯度實(shí)驗，接種體積為100-200 uL（細(xì)胞過量可能導(dǎo)致泄漏）。
裸鼠皮下注射HepG2細(xì)胞4周后腫瘤形成圖
接種細(xì)胞要選擇生長狀態(tài)良好，無病毒、細(xì)菌或支原體等污染，處于對數(shù)生長期的細(xì)胞。細(xì)胞短途運(yùn)輸時可采用濕冰運(yùn)輸，如用冰袋，冰袋不可直接接觸細(xì)胞，若短時間內(nèi)運(yùn)輸室溫即可。
動物
選擇了合適的細(xì)胞株后，就要考慮用什么品系的小鼠來接種。對于來自小鼠的腫瘤細(xì)胞系，需要保持小鼠背景一致，如果腫瘤細(xì)胞系接種到背景品系不同的小鼠上，由于免疫系統(tǒng)的攻擊，腫瘤細(xì)胞很難成瘤。如MC38是來自B6小鼠的結(jié)腸癌細(xì)胞系，所以適于其接種的小鼠背景的是B6。
而藥效實(shí)驗用的細(xì)胞株多為人源細(xì)胞株，人源細(xì)胞株更為接近人類腫瘤增殖情況，但卻需要選擇免疫缺陷小鼠，如M-NSG小鼠。Raji細(xì)胞系是人Burkitt's 淋巴瘤細(xì)胞系，皮下接種后，腫瘤生長較慢，20天后腫瘤體積達(dá)到1000mm3。
確定品系后，就要選擇合適鼠齡的小鼠，通常為6-8周齡的小鼠，老年鼠皮下脂肪及結(jié)締組織疏松，容易接出不規(guī)則的腫瘤。同一批小鼠周齡和體重差異要盡量小。小鼠進(jìn)入動物房后適應(yīng)性飼養(yǎng)一周左右，待其適應(yīng)新環(huán)境后再進(jìn)行接種實(shí)驗。
圖3 MC38在C57BL/6小鼠皮下的成瘤曲線以及Raji小鼠在M-NSG小鼠皮下的成瘤曲線
操作
實(shí)驗員豐富的接種經(jīng)驗極為重要，新手往往因經(jīng)驗少而常出問題。如實(shí)驗前準(zhǔn)備不夠充分，接種過程中手抖等。且新手實(shí)驗員操作速度較慢而使接種時間延長，使細(xì)胞活性下降進(jìn)而影響成瘤率。所以，新手要多多練習(xí)接種或請經(jīng)驗豐富的人員完成接種環(huán)節(jié)。
接種部位及接種深度也極為重要。選擇血管豐富的區(qū)域接種，如腋窩部位或頸后方的肩胛骨上側(cè)皮下等。進(jìn)針時先用針頭刺破皮膚，持平注射器使針頭在皮下行進(jìn)一段距離，稍微上挑后開始注射，注射過程中不可使針頭移行。注射結(jié)束后壓著針頭快速拔出，同時用棉簽輕壓進(jìn)針孔處以免有細(xì)胞液流出。
接種環(huán)節(jié)應(yīng)由一人完成所有動物接種，避免同一實(shí)驗多人。因每個人對卡尺的松緊和測量方向操作不同，為保持腫瘤體積測量的一致性，后續(xù)的量瘤環(huán)節(jié)也需要同一個人完成。
更多疑問？
1）如何避免串狀腫瘤
抽取細(xì)胞后，可用酒精擦拭針頭，避免針頭上的腫瘤細(xì)胞沾到行針路徑上。
2）接種針有氣泡怎么辦?
多取適當(dāng)體積的液體，然后針尖朝上，往回吸一點(diǎn)，形成一個空間，再將空氣推出，同時有部分液體推出，氣泡即可以排除了。此時要注意腫瘤細(xì)胞比較粘，盡量排在紙上或者離心管里。
3）瘤子長不出來是怎么回事？
一方面可能是細(xì)胞狀態(tài)差，活力不好，或是腫瘤細(xì)胞不易成瘤，需加入Matrigel輔助或增大接種量或更換細(xì)胞系；一方面可能是小鼠周齡太大，或小鼠免疫排斥，建議更換免疫缺陷程度更大的小鼠（M-NSG小鼠＞NOD SCID小鼠＞裸小鼠）
4）小鼠瘤子長起來又消失？
腫瘤塊先縮小，后變大很常見，很可能是炎癥反應(yīng)，導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞被小鼠自身吸收，建議繼續(xù)觀察經(jīng)過幾周是否能長出來，若否，則需要更換小鼠。
5）是否可以在一只小鼠進(jìn)行多個點(diǎn)荷瘤？
不可以，一只老鼠就只能接種一個點(diǎn)。因為一個老鼠身上有多個腫瘤塊的情況下，可能會相互影響。
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Cre-ERT2在無Tamoxifen誘導(dǎo)的情況下，在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)處于無活性狀態(tài)；當(dāng)Tamoxifen誘導(dǎo)后，Tamoxifen的代謝產(chǎn)物4-OHT（雌激素類似物）與ERT結(jié)合，可使Cre-ERT2進(jìn)核發(fā)揮Cre重組酶活性。
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