小核酸藥物主要成分是由少量核苷酸組成的短鏈核酸，它們旨在通過序列互補(bǔ)靶標(biāo)mRNA，使其降解或抑制，從而實(shí)現(xiàn)相關(guān)基因的表達(dá)沉默。在創(chuàng)新藥蓬勃發(fā)展的今天，小核酸藥被認(rèn)為將帶來“除小分子藥和抗體藥”之外的第三次制藥浪潮。

1. 小核酸藥物發(fā)展史

任何一項(xiàng)新技術(shù)的發(fā)展都不是一帆風(fēng)順的，尤其是具有革命性的技術(shù)。小核酸藥物的路也是歷經(jīng)波折，直到近年才初步被市場(chǎng)認(rèn)可，其發(fā)展年譜上重大事件如下圖所示：

小核酸藥物的發(fā)展歷經(jīng)波折

數(shù)據(jù)來源：Frost&Sullivan

近年來FDA已批準(zhǔn)了多款小核酸藥物，主要用于治療罕見病。截止2020年，全球累計(jì)超50個(gè)小核酸藥物處于臨床研究階段，覆蓋神經(jīng)、心血管、感染和腫瘤等領(lǐng)域。

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與全球相比，我國小核酸藥物的開發(fā)仍處于發(fā)展初期，國內(nèi)首款siRNA藥物的臨床獲批時(shí)間相比全球晚了11年；此外，從產(chǎn)品類型和靶點(diǎn)來看，多數(shù)企業(yè)選擇研發(fā)的是國外已上市藥物的類產(chǎn)品，仍然處于me-too階段。不過隨著國內(nèi)企業(yè)的加速追趕，有望逐步進(jìn)入差異化創(chuàng)新和突破型創(chuàng)新階段，迎來快速增長。

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2.小核酸藥物簡(jiǎn)介

小核酸藥物以mRNA為靶點(diǎn)，只需確定致病序列，設(shè)計(jì)相應(yīng)的RNA片段，無需考慮復(fù)雜的蛋白結(jié)構(gòu)，因此早期研發(fā)速度遠(yuǎn)遠(yuǎn)快于其他藥物；此外，其主要通過特殊的遞送系統(tǒng)直接到達(dá)目標(biāo)組織，特異性高；而更讓慢病患者心動(dòng)的一點(diǎn)是，小核酸藥物可以做到半年甚至1年給藥一次！

2.1?小核酸藥物的分類

小核酸藥物可以分為反義寡核苷酸（ASO）、小干擾RNA（siRNA）、miRNA、寡核苷酸適配子、CpG寡核苷酸等，它們的作用機(jī)制大都是相似的，通過與mRNA互補(bǔ)配對(duì)來發(fā)揮功能，而核酸適配體的作用機(jī)制則比較獨(dú)特，它們各自的具體機(jī)制如下：

• ASO藥物：合成15-30nt的單鏈DNA或RNA，該序列進(jìn)入細(xì)胞后與靶標(biāo)mRNA結(jié)合，抑制mRNA翻譯或誘發(fā)mRNA降解。

• RNAi藥物：合成短雙鏈RNA，進(jìn)入細(xì)胞后正義鏈被降解，反義鏈與多蛋白組分形成RISC復(fù)合體，RISC中保留的反義鏈與靶基因的mRNA特異地互補(bǔ)，同時(shí)RISC具有核酸酶活性，能將靶基因的mRNA切割降解或抑制其翻譯活性。

• miRNA藥物：其機(jī)制是部分鏈的配對(duì)，與siRNA不同，miRNA只是在種子區(qū)的幾個(gè)堿基進(jìn)行配對(duì)，所以miRNA可以調(diào)控多個(gè)分子。

• 核酸適配體：核酸適配體是折疊成獨(dú)特的三維結(jié)構(gòu)的短單鏈寡核苷酸，利用其三維結(jié)構(gòu)特異性結(jié)合較大范圍的目標(biāo)，包括蛋白質(zhì)、小分子、金屬離子、病毒、細(xì)菌和全細(xì)胞，其高特異性和結(jié)合親和力可達(dá)到抗體水平。與抗體相比，核酸適配體具有體外篩選快速、可無細(xì)胞化學(xué)合成以及體積小，具有較低免疫原性和較強(qiáng)組織穿透力等優(yōu)勢(shì)。

ASO和RNAi機(jī)制模式圖

2.2?小核酸藥物的遞送系統(tǒng)

小核酸藥物設(shè)計(jì)原理很簡(jiǎn)單，但它們都需要被遞送到靶點(diǎn)細(xì)胞內(nèi)發(fā)揮作用，而且不能激發(fā)有害免疫反應(yīng)。遞送技術(shù)是小核酸藥物成敗的關(guān)鍵所在，也是一個(gè)專利壁壘遍布的地方。

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迄今為止，科學(xué)家們已經(jīng)開發(fā)出多種RNA遞送技術(shù)，它們可以分為2大類：一是化學(xué)修飾技術(shù)，通過改造核酸分子提高其穩(wěn)定性，并避免免疫系統(tǒng)的識(shí)別；二是遞送載體，遞送載體可以使核酸免受血清核酸酶活性和免疫成分的影響，而且可以決定藥物的生物分布[1]。

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化學(xué)修飾技術(shù)

化學(xué)修飾技術(shù)主要應(yīng)用于分子量較小的RNA分子，它們包括siRNA、反義寡核苷酸（ASO）等。通過在特定位置進(jìn)行化學(xué)修飾，提高這些小核酸分子的穩(wěn)定性、避免激發(fā)免疫系統(tǒng)反應(yīng)，并利用真核細(xì)胞中已有的酶來行使它們的功能。

如GalNac(N-乙?；陌肴樘前?修飾，通過將GalNac以三價(jià)態(tài)的方式共價(jià)偶聯(lián)至核酸3’末端構(gòu)成，這是當(dāng)前小核酸藥物遞送最常用的系統(tǒng)之一，近期上市的三款siRNA藥物均采用GalNac修飾。肝臟表面的受體CDR可以結(jié)合血液中的乳糖，并通過胞吞吸收，GalNac是與CDR結(jié)合能力最強(qiáng)的一種乳糖類似物，高度靶向肝細(xì)胞，遞送效率很高。

ASO, siRNA等小分子量RNA療法

基于脂質(zhì)的遞送系統(tǒng)

基于脂質(zhì)的遞送系統(tǒng)包括膠束（micelles），脂質(zhì)體（liposome）和脂質(zhì)納米顆粒（LNP），是使用最早也是當(dāng)前最成熟的遞送系統(tǒng)。RNA帶負(fù)電，帶正電的脂質(zhì)會(huì)和它結(jié)合，形成很小的反向交錯(cuò)結(jié)構(gòu)的粒子，外面再包裹磷脂，形成的脂質(zhì)復(fù)合體可以將攜帶的RNA遞送到目的組織。

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由于肝臟是脂質(zhì)代謝的中心，這種遞送系統(tǒng)在肝臟上的應(yīng)用最為成熟，目前已有上萬種結(jié)構(gòu)迥異的脂質(zhì)遞送系統(tǒng)被創(chuàng)建出來，在小鼠模型中，現(xiàn)在向肝臟遞送的siRNA所需的劑量已經(jīng)可以做到比初代遞送系統(tǒng)低500多倍。

基于脂質(zhì)的RNA遞送系統(tǒng)

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此外，改變LNP的脂質(zhì)組分或者添加新的脂質(zhì)分子，可以促進(jìn)LNP遞送到肝臟以外的組織。Intellia Therapeutics和Beam Therapeutics公司都已經(jīng)分享了將mRNA遞送到造血干細(xì)胞和祖細(xì)胞中的LNP信息，它們帶來了開發(fā)靶向體內(nèi)造血干細(xì)胞療法的希望。

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值得一提的是，LNP材料已經(jīng)遍布專利壁壘，Arbutus公司是國際LNP領(lǐng)域的龍頭公司，廣泛且深入地覆蓋了陽離子脂質(zhì)及PEG脂質(zhì)方面的大量專利，包括眾多的化合物結(jié)構(gòu)專利、LNP組合物及其配比專利和應(yīng)用專利，mRNA疫苗三巨頭都曾向Arbutus尋求LNP的專利授權(quán)，Moderna還曾向美國專利商標(biāo)局申請(qǐng)無效化Arbutus的部分專利。由于Arbutus專利覆蓋的完整性，導(dǎo)致其他公司如果不想向Arbutus繳納巨額的專利授權(quán)費(fèi)，就只能另辟蹊徑，自行開發(fā)遞送系統(tǒng)。

基于聚合物的納米顆粒

很多非病毒遞送系統(tǒng)可以使用聚合物和基于聚合物的納米顆粒，通過調(diào)節(jié)聚合物的極性、降解性和分子量，可以改變聚合物遞送RNA進(jìn)入細(xì)胞的效率。比如，通過攜帶胺基讓聚合物呈陽性，提高聚合物與RNA分子的結(jié)合能力；通過讓聚合物分子攜帶可被生物降解的酯鍵，可以降低聚合物的細(xì)胞毒性。

基于聚合物的RNA遞送系統(tǒng)

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還有一類可以用來遞送RNA的聚合物稱為樹枝狀大分子（dendrimers），它們以一個(gè)核心分子為中心，通過聚合反應(yīng)重復(fù)增長合成樹枝狀的聚合物，樹枝上修飾有陽離子基團(tuán)，可以與帶負(fù)電RNA生成復(fù)合物。這種結(jié)構(gòu)可以將RNA遞送到中樞神經(jīng)系統(tǒng)，將siRNA遞送到肝臟內(nèi)皮細(xì)胞中，還能用于肌肉注射，并且這種樹枝狀大分子的結(jié)構(gòu)可不易被降解，可以增加給藥間隔。

適合在臨床環(huán)境下使用的遞送系統(tǒng)的特征

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遞送系統(tǒng)是小核酸藥物開發(fā)的關(guān)鍵所在，一款成功的遞送系統(tǒng)通常需要具有以下特征：安全性高，可以在體內(nèi)生物降解；特異性高，脫靶率低；療效高，毒性低，重新性好等。

3. 小核酸藥物的研發(fā)現(xiàn)狀

目前，全球小核酸藥物進(jìn)入臨床管線的有80多個(gè)，并有10個(gè)已經(jīng)進(jìn)入了臨床三期，獲批的小核酸藥物則有14款（早期3款藥物已退市，數(shù)據(jù)截至2021年12月31日）。其中渤健與Ionis開發(fā)的用于治療脊髓性肌萎縮癥的Nusinersen，2021年全球銷售額達(dá)19.51億美元，讓大家看到了小核酸藥物的市場(chǎng)潛力；諾華與Alnylam開發(fā)的長效降脂藥Inclisiran，一年僅需注射兩次，讓大家看到了慢病治療的新模式。

上市小核酸藥物概覽

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從上述已上市藥物可見，小核酸藥物的適應(yīng)癥多針對(duì)罕見病，這導(dǎo)致小核酸藥物在市場(chǎng)上的存在感較低，對(duì)大多數(shù)人而言只是一個(gè)遙遠(yuǎn)的概念。不過這種情況隨著小核酸藥物在慢病、肝炎、腫瘤等領(lǐng)域的進(jìn)展正在慢慢改變。下面我們分別介紹下不同領(lǐng)域內(nèi)小核酸藥物的研發(fā)現(xiàn)狀。

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3.1 ATTR相關(guān)疾病

轉(zhuǎn)甲狀腺素蛋白淀粉樣變性（transthyretinamyloidosis，ATTR）是由轉(zhuǎn)甲狀腺素蛋白（transthyretin，TTR）錯(cuò)誤折疊導(dǎo)致其在組織中異常沉積所致的系統(tǒng)性疾病，受累臟器主要是周圍神經(jīng)和心臟。

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TTR是一種由肝臟合成的血漿轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，正常生理?xiàng)l件下以可溶性四聚體形態(tài)轉(zhuǎn)運(yùn)甲狀腺素和視黃醇，但基因突變及年齡增長均可使TTR四聚體蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定，其單體錯(cuò)誤折疊形成遺傳型淀粉樣變（hATTR）或野生型淀粉樣變（wtATTR）沉積于組織中，進(jìn)一步引起轉(zhuǎn)甲狀腺素蛋白淀粉樣變性多發(fā)性神經(jīng)?。ˋTTR-PN）或轉(zhuǎn)甲狀腺素蛋白淀粉樣變性心肌病（ATTR-CM）[2]。

ATTR發(fā)病歷程

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目前，全球有ATTR-CM患者30萬~50萬，ATTR-PN患者1萬~4萬。由于沒有足夠高效的臨床解決方案，ATTR一直是各大藥企研發(fā)的熱點(diǎn)。當(dāng)前Alnylam、Pfizer、BridgeBio、Ionis和AZ、Intellia和再生元均有在研的ATTR藥物，其中Alnylam連續(xù)開發(fā)多個(gè)代際產(chǎn)品制霸ATTR這個(gè)患者人數(shù)眾多的疾病領(lǐng)域。

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Alnylam第一代ATTR產(chǎn)品Patisiran就是由LNP攜帶小核酸去靶向降解參與生成TTR蛋白的mRNA；LNP構(gòu)成決定了它主要靶向肝臟，容易引發(fā)過敏等不良反應(yīng)。后來，Alnylam開發(fā)了以GalNAc為代表的偶聯(lián)遞送系統(tǒng)，增強(qiáng)了小核酸藥物的靶向特異性，降低循環(huán)中的藥物清除，但也主要用于肝臟給藥，并且存在內(nèi)涵體逃逸問題。

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3.2 心血管疾病

心血管疾病對(duì)健康的危害，想來大家已經(jīng)非常清楚了。不同于罕見病的無藥可治，市面上通過降血脂改善心血管疾病癥狀的藥物并不少，但長期用藥容易引起患者內(nèi)心的抵觸，往往導(dǎo)致患者依從性低。小核酸藥物可以極大的降低給藥頻率，可以很好的解決這個(gè)問題。

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目前，有多個(gè)以不同血脂類型為靶點(diǎn)的小核酸藥物正在研發(fā)中，包括靶向PCSK9的小核酸藥物、靶向Lp(a)的小核酸藥物、靶向富含甘油三酯脂蛋白的小核酸藥物等[3]。

代謝紊亂類小核酸藥物主要靶點(diǎn)

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PCSK9可與低密度脂蛋白受體（LDLR）結(jié)合，并將LDLR轉(zhuǎn)移至溶酶體內(nèi)破壞，增加了LDLR的降解，進(jìn)而促使循環(huán)中LDLC水平升高^[4]。。2021年12月，PCSK9 siRNA藥物L(fēng)eqvio（inclisiran）獲FDA批準(zhǔn)上市，實(shí)現(xiàn)一年兩針的用藥頻率，可持續(xù)有效降脂，是心血管領(lǐng)域的第一個(gè)小核酸藥物。

PCSK9作用原理

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Lp(a)具有促動(dòng)脈粥樣硬化、促炎和促血栓形成作用，被認(rèn)為是心血管疾病的遺傳性、獨(dú)立因果風(fēng)險(xiǎn)因素。目前尚無針對(duì)Lp(a)的獲批臨床藥物，靶向于Lp(a)的小核酸藥物將有望成為首個(gè)可有效降低Lp(a)的藥物。目前Olpasiran(AMG890和SLN360)對(duì)于降低Lp(a)的安全性及有效性的研究均在進(jìn)行，初步結(jié)果均顯示具有較好的安全性及有效性，有望拔得頭籌。

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Lp(a) 的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)及相關(guān)疾病

靶向富含甘油三酯脂蛋白（ANGPTL3,ApoC3等）的小核酸藥物也有多家公司布局，當(dāng)前有volanesorsen、Vupanorsen、ARO-ANG3 、Volanesorsen、Olezarsen等候選藥物已經(jīng)進(jìn)入了臨床試驗(yàn)。Volanesorsen的III期臨床結(jié)果顯示，家族性乳糜微粒血癥綜合征及部分性脂肪代謝障礙患者每周給藥一次，可以降低血液中甘油三酯水平77%-88%。

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3.3 乙肝

乙肝是由乙型肝炎病毒（HBV）引起的一種傳染病，全球乙肝病毒攜帶者約2.96億人，我國乙肝攜帶者約8000萬左右。目前治療乙肝的藥物主要是恩替卡韋、替諾福韋等核苷類藥物，這些藥物只能抑制HBV DNA復(fù)制，需要終生服藥。

成人慢性乙型肝炎病毒(HBV)復(fù)制周期

乙肝病毒基因組cccDNA能夠轉(zhuǎn)錄多個(gè)不同長度的RNA，并翻譯為多種病毒蛋白，其中DR1和DR2兩個(gè)片段在多個(gè)轉(zhuǎn)錄本中相同^[5]。。因此針對(duì)該區(qū)域設(shè)計(jì)的小核酸藥物可直接作用于病毒轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生的所有mRNA，在病毒蛋白產(chǎn)生前發(fā)揮抑制作用。Arrowhead和強(qiáng)生共同開發(fā)的siRNA藥物JNJ-3989，可以沉默所有HBV基因產(chǎn)物，經(jīng)GalNAc修飾后，這種小核酸藥物能夠被高效遞送至肝臟組織，抑制所有HBV蛋白的產(chǎn)生。

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小核酸藥物的研究是從罕見病開始的，目前已經(jīng)上市的藥物也多是針對(duì)罕見病治療的，如脊髓性肌萎縮癥、杜氏肌營養(yǎng)不良、急性肝卟啉癥等；隨著研究的深入，目前已經(jīng)有多家公司開始在高血糖、高血脂、前列腺癌、乙肝等疾病上進(jìn)行小核酸藥物的開發(fā)，可以預(yù)見在不久的將來，小核酸藥物將迎來大爆發(fā)的時(shí)代。

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4. 展望

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小核酸藥物相比現(xiàn)有小分子和抗體藥物具有藥物靶點(diǎn)篩選快、研發(fā)成功率高、不易產(chǎn)生耐藥性、更廣治療領(lǐng)域和長效性等優(yōu)點(diǎn)，并且有望從“源頭”解決疾病，具有較大發(fā)展?jié)摿?。目前小核酸藥物處境類?0年前的抗體藥物，仍然存在部分技術(shù)難關(guān)有待突破，包括肝臟以外組織的特異性遞送難題以及早期脫靶發(fā)現(xiàn)等問題。

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我國小核酸藥物研究起步較晚，目前LNP和GalNAc-siRNA綴合物技術(shù)的核心專利仍然掌握在國外企業(yè)手中，國內(nèi)企業(yè)需要獲得相關(guān)授權(quán)或從零起步開發(fā)自主技術(shù)平臺(tái)，因此需要奮起直追。

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南模生物針對(duì)小核酸藥物研究的常見靶點(diǎn)PCSK9、ANGPTL3、C3、C5等自主研發(fā)了合適的人源化動(dòng)物模型，可用于小核酸藥物的臨床前研究，模型信息詳見下表，歡迎前來咨詢。

參考文獻(xiàn)：

[1]Paunovska et al., (2022). Drug delivery systems for RNA therapeutics. Nature Reviews Genetics, https://doi.org/10.1038/s41576-021-00439-4

[2]JACC CardioOncol . 2021 Oct 19;3(4):488-505. doi: 10.1016/j.jaccao.2021.06.006. eCollection 2021 Oct.

[3]Lipids Health Dis . 2022 Apr 23;21(1):41. doi: 10.1186/s12944-022-01649-3.

[4]?PCSK9 Inhibition With Monoclonal Antibodies: Modern Management of Hypercholesterolemia，doi/epdf/10.1002/jcph.766

Nat Rev Dis Primers . 2018 Jun 7;4:18035. doi: 10.1038/nrdp.2018.35.