基因編輯技術(shù)
為了使我們的客戶獲得理想的動(dòng)物模型，符合他們從基礎(chǔ)科研到藥物研發(fā)的研究需求，南模生物始終專注于模式生物的基因編輯與模型研發(fā)，擁有專業(yè)的項(xiàng)目設(shè)計(jì)團(tuán)隊(duì)與人工智能自動(dòng)化分析系統(tǒng)SmartEddi，以及經(jīng)驗(yàn)豐富、受過嚴(yán)格專業(yè)培訓(xùn)的實(shí)驗(yàn)技術(shù)隊(duì)伍，自2000年以來建立了穩(wěn)定而高效的基因工程動(dòng)物研發(fā)服務(wù)平臺(tái)，致力于提供最高標(biāo)準(zhǔn)的基因修飾動(dòng)物模型解決方案。
我們使用以下三種基因修飾技術(shù)構(gòu)建基因工程動(dòng)物模型：
三種基因修飾技術(shù)的比較
| 核心技術(shù)類型 |
技術(shù)要點(diǎn) | 周期 | 技術(shù)應(yīng)用 | 優(yōu)缺點(diǎn) |
|---|---|---|---|---|
| CRISPR/Cas9技術(shù) | Cas9 核酸酶剪切特定靶點(diǎn) | 6–9 個(gè)月 | 基因敲除、條件性基因敲除、基因定點(diǎn)插入、點(diǎn)突變、基因人源化 | 技術(shù)周期短、效率高；有潛在脫靶風(fēng)險(xiǎn)，但風(fēng)險(xiǎn)可控（選擇合適的sgRNA ? 可有效降低脫靶風(fēng)險(xiǎn)；通過測序可確定是否脫靶；傳代可去除脫靶位點(diǎn)） |
| ESC 打靶 | 同源重組對靶基因進(jìn)行修飾 | 9–12 個(gè)月 | 基因敲除、條件性基因敲除、基因定點(diǎn)插入、點(diǎn)突變、基因人源化 | 技術(shù)成熟、效果穩(wěn)定、無脫靶，可實(shí)現(xiàn)大片段重組；實(shí)驗(yàn)周期較長 |
Piggybac轉(zhuǎn)基因技術(shù) |
轉(zhuǎn)座酶將片段整合到基因組 | 3–6 個(gè)月 | 基因過表達(dá) | 單拷貝插入，表達(dá)陽性率高；多位點(diǎn)插入，后續(xù)實(shí)驗(yàn)需建系 |
關(guān)于三種基因修飾技術(shù)的詳細(xì)介紹，請見下文，以小鼠為例。
ES細(xì)胞打靶
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在小鼠ES細(xì)胞中，利用同源重組原理（也就是核苷酸序列在兩個(gè)相似或相同的DNA分子之間交換的基因重組），獲得帶有研究者預(yù)先設(shè)計(jì)的遺傳修飾的中靶ES細(xì)胞。經(jīng)過遺傳修飾的ES細(xì)胞仍然保持分化的全能性，可以發(fā)育為嵌合體動(dòng)物的生殖細(xì)胞，使得經(jīng)過修飾的遺傳信息經(jīng)生殖系遺傳，最終獲得基因修飾小鼠模型。發(fā)展至今，仍是最為經(jīng)典、可靠的小鼠基因修飾或編輯技術(shù)。
目前南模生物可提供3種遺傳背景的小鼠ES細(xì)胞：C57BL/6，129/S6，B6;129。
可用于獲得以下類型小鼠模型：
基因敲除
條件性基因敲除
KO first
基因敲入
點(diǎn)突變
條件性點(diǎn)突變
定點(diǎn)基因過表達(dá)
人源化
南模生物會(huì)對每個(gè)項(xiàng)目進(jìn)行分析與評估，綜合時(shí)間與風(fēng)險(xiǎn)因素從而選用最合適的技術(shù)（ES細(xì)胞打靶或CRISPR基因編輯）。
聯(lián)系我們，與南模生物的技術(shù)顧問討論如何應(yīng)用ES細(xì)胞打靶技術(shù)獲得您的動(dòng)物模型吧！
利用ES細(xì)胞打靶技術(shù)獲得小鼠模型的一般流程
設(shè)計(jì)并構(gòu)建同源重組載體
將同源重組載體轉(zhuǎn)入小鼠ES細(xì)胞中
篩選并驗(yàn)證中靶的陽性ES細(xì)胞克隆
將陽性ES細(xì)胞注射到小鼠囊胚腔中
將注射后的小鼠囊胚移植到假孕母鼠子宮內(nèi)
獲得并篩選驗(yàn)證陽性嵌合體小鼠F0
陽性F0通過與野生型小鼠或FLP小鼠交配獲得F1代雜合子小鼠
CRISPR基因編輯
CRISPR / Cas9核酸酶系統(tǒng)需要兩個(gè)組分：用于切割靶序列的Cas酶和與20個(gè)堿基對（bp）的靶序列結(jié)合指導(dǎo)RNA（sgRNA）。利用靶點(diǎn)特異性的sgRNA 指導(dǎo) Cas9 核酸酶在基因組上的特定靶點(diǎn)進(jìn)行DNA雙鏈剪切。通過非同源末端連接（NHEJ）可導(dǎo)致移碼突變，實(shí)現(xiàn)基因敲除（KO） ；通過同源重組修復(fù)（HR）可將外源片段整合到基因組指定位點(diǎn)（KI）。
CRISPR基因編輯技術(shù)的優(yōu)勢
與傳統(tǒng)的基因打靶方法相比，大大縮短了研發(fā)周期。
打破對小鼠遺傳品系的限制，實(shí)現(xiàn)不同遺傳背景或在已有基因修飾小鼠模型基礎(chǔ)上的基因編輯。
降低基因敲除、敲入小鼠模型的定制成本。
南模生物使用最新的CRISPR / Cas9基因編輯技術(shù)為您定制屬于您的基因工程小鼠模型。
我們會(huì)對每個(gè)項(xiàng)目進(jìn)行分析與評估，綜合時(shí)間與風(fēng)險(xiǎn)因素從而選用最合適的技術(shù)（CRISPR基因編輯或ES細(xì)胞打靶）。
聯(lián)系我們，與南模生物的技術(shù)顧問討論如何應(yīng)用CRISPR技術(shù)獲得您的動(dòng)物模型吧！
利用CRISPR基因編輯技術(shù)獲得小鼠模型的一般流程
選擇靶位點(diǎn)并設(shè)計(jì)sgRNA，設(shè)計(jì)同源重組載體（可選）
制備sgRNA和Cas9 mRNA，構(gòu)建同源重組載體（可選）
將sgRNA和Cas9mRNA（以及同源重組載體（可選））注入小鼠受精卵中
注射后的受精卵移植到假孕母鼠輸卵管
獲得并篩選驗(yàn)證陽性F0代小鼠
陽性F0通過與野生型小鼠交配獲得F1代雜合子小鼠
轉(zhuǎn)基因技術(shù)
通過原核顯微注射，將設(shè)計(jì)好的基因（或多基因）注射并隨機(jī)整合到小鼠基因組中，獲得隨機(jī)插入的轉(zhuǎn)基因小鼠。也可以利用高效轉(zhuǎn)座子piggyBac系統(tǒng)，更高效地獲得轉(zhuǎn)基因小鼠模型。
聯(lián)系我們，與南模生物的技術(shù)顧問討論如何獲得您的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物模型吧！
獲得隨機(jī)轉(zhuǎn)基因小鼠模型的一般流程
設(shè)計(jì)并構(gòu)建轉(zhuǎn)基因質(zhì)粒
將線性化的轉(zhuǎn)基因質(zhì)粒片段注射到小鼠受精卵中
注射后的受精卵移植到假孕母鼠輸卵管
獲得并篩選驗(yàn)證陽性F0代小鼠
利用高效轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)獲得轉(zhuǎn)基因小鼠模型的一般流程
設(shè)計(jì)并構(gòu)建piggyBac轉(zhuǎn)座子質(zhì)粒
將轉(zhuǎn)座子質(zhì)粒與piggyBac轉(zhuǎn)座酶共同注射到小鼠受精卵中
注射后的受精卵移植到假孕母鼠輸卵管
獲得并篩選驗(yàn)證陽性F0代小鼠
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Cre-ERT2在無Tamoxifen誘導(dǎo)的情況下，在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)處于無活性狀態(tài)；當(dāng)Tamoxifen誘導(dǎo)后，Tamoxifen的代謝產(chǎn)物4-OHT（雌激素類似物）與ERT結(jié)合，可使Cre-ERT2進(jìn)核發(fā)揮Cre重組酶活性。
查看常見的基因工程小鼠可以分為兩種命名方式，包括基因定點(diǎn)修飾的小鼠命名，比如：敲除、敲入、點(diǎn)突變等等，和隨機(jī)轉(zhuǎn)基因的小鼠命名。
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