罕見(jiàn)病IgG4 RD模型
免疫球蛋白G4相關(guān)疾病（immunoglobulin G4-related disease，IgG4-RD）是一種慢性、進(jìn)行性炎癥伴纖維化的疾病，可累及身體幾乎所有器官，如中樞神經(jīng)系統(tǒng)、淚腺、唾液腺、甲狀腺、肺、乳腺、胰腺、膽管、肝臟、胃腸道、前列腺、后腹膜、皮膚和淋巴結(jié)等。根據(jù)累及組織或器官的不同，疾病名稱有所不同，如唾液腺受累的米庫(kù)利茲病，胰腺受累的自身免疫性胰腺炎，膽管受累的硬化性膽管炎，后腹膜受累的腹膜后纖維化等。
雖然累及的組織和器官不同，IgG4-RD的臨床表現(xiàn)各異，但是都有相同的免疫學(xué)和病理學(xué)特點(diǎn)，包括：1）血清IgG4水平升高；2）病變部位有大量淋巴細(xì)胞和漿細(xì)胞浸潤(rùn)；3）T淋巴細(xì)胞和B淋巴細(xì)胞之間相互作用，共同導(dǎo)致了受累器官的炎性損傷和纖維化[1]（Fig1）；4）閉塞性靜脈炎；5）輕到中度嗜酸性粒細(xì)胞浸潤(rùn)。
Fig1. IgG4-RD中T淋巴細(xì)胞和B淋巴細(xì)胞之間的相互作用
IgG4-RD直到2011年才獲得國(guó)際統(tǒng)一認(rèn)可的疾病命名，截止目前，IgG4-RD的致病機(jī)制尚不完全清楚，主要是因?yàn)槿狈线m和可靠動(dòng)物模型。早前雖已報(bào)道了幾種IgG4-RD相關(guān)研究的小鼠模型：Cd28缺陷的NOD小鼠[2]，Tgfbr2-KO小鼠[3]，Ela1-LTab小鼠[4]，Aire-KO 小鼠[5]，HLA-DRB1*0405轉(zhuǎn)基因小鼠[6]，但這些小鼠組織病變的發(fā)展僅限于胰腺和/或唾液腺，且Th亞群的反應(yīng)模式仍未完全確定。因此，亟待開(kāi)發(fā)新的動(dòng)物模型幫助確定IgG4-RD的致病機(jī)制。
IgG4與Lat-Y136F小鼠模型
由于IgG4-RD是一種自身免疫性疾病，與T細(xì)胞的參與具有較強(qiáng)相關(guān)性，而參與T細(xì)胞活化的重要銜接蛋白為L(zhǎng)AT（T細(xì)胞活化連接蛋白），對(duì)Lat進(jìn)行基因編輯就是科學(xué)家們探索動(dòng)物模型的一種新思路。
LAT蛋白分子量大約為36-38kDa，可以在TCR發(fā)生交聯(lián)后被迅速磷酸化的蛋白。LAT屬于完整的跨膜銜接蛋白，并通過(guò)近膜的兩個(gè)棕櫚?；蛄卸ㄎ挥赥細(xì)胞上的富含糖脂的脂筏區(qū)域，是T細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中ZAP-70蛋白酪氨酸激酶的主要作用底物之一，并可招募和活化許多下游信號(hào)分子，諸如Gads，Grb2以及磷脂酶C-γ1 (PLC- γ1)等，參與TCR介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)到，并在T細(xì)胞發(fā)育和活化的過(guò)程中起重要作用。
Lat-Y136F敲入小鼠模型，是將小鼠第136位的酪氨酸替換為苯丙氨酸，導(dǎo)致其失去與PLC- γ1的結(jié)合的能力，小鼠繼而發(fā)展為淋巴細(xì)胞增殖紊亂，并表現(xiàn)出CD4?+T細(xì)胞的擴(kuò)增和多種Th2型細(xì)胞因子的高表達(dá)[7,8]，同時(shí)，B細(xì)胞大量活化，血清IgG1和IgE[9]水平升高。這些表型與IgG4-RD的病理學(xué)基礎(chǔ)十分相似，因此，研究人員預(yù)測(cè)LatY-136F敲入小鼠是一種更加符合人類IgG4-RD研究的小鼠模型。為了證實(shí)這一觀點(diǎn)，他們展開(kāi)了一些列的表型檢測(cè)實(shí)驗(yàn)。
1.?Lat-Y136F敲入小鼠表現(xiàn)出與IgG4-RD患者相似的多器官累及特征
研究人員[10]對(duì)LatY-136F敲入小鼠的唾液腺、胰腺和腎臟進(jìn)行了組織病理學(xué)分析。6周齡的LatY136F敲入小鼠在唾液腺、胰腺導(dǎo)管、胰腺的動(dòng)脈和靜脈，腎臟皮質(zhì)和髓質(zhì)周圍均有明顯的炎癥病變（Fig2）。
Fig2. Lat-Y136F敲入小鼠胰腺、唾液腺和腎臟的組織病理學(xué)特征
免疫染色顯示Lat-Y136F敲入小鼠病變組織中主要是單核細(xì)胞浸潤(rùn)（Fig3）。在唾液腺、胰腺和腎臟炎癥病灶可見(jiàn)漿細(xì)胞、CD4+T細(xì)胞和巨噬細(xì)胞的大量浸潤(rùn)，以及少量CD8+T細(xì)胞的浸潤(rùn)。值得注意的是，浸潤(rùn)各器官的漿細(xì)胞主要表達(dá)IgG1(人類IgG4的同源物)。
Fig3. Lat-Y136F敲入小鼠病變組織中漿細(xì)胞、T細(xì)胞和巨噬細(xì)胞的免疫染色
2. Lat-Y136F敲入小鼠可發(fā)展出纖維化和閉塞性靜脈炎
除了觀察到病變組織出現(xiàn)淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)，Azan染色顯示所有Lat-Y136F敲入小鼠的唾液腺、胰腺和腎臟會(huì)發(fā)展出嚴(yán)重的纖維化病變。6周齡后，Lat-Y136F敲入小鼠的纖維化評(píng)分顯著高于對(duì)照組小鼠，并隨年齡增長(zhǎng)纖維化程度不斷加重。
閉塞性靜脈炎是IgG4-RD的另一特征性病變。檢測(cè)發(fā)現(xiàn)10周齡和20周齡的Lat-Y136F敲入小鼠，肺中會(huì)出現(xiàn)典型的閉塞性靜脈炎，胰腺中也會(huì)出現(xiàn)有類似的血管病變（Fig4）。
Fig4. Lat-Y136F敲入小鼠可發(fā)展出纖維化和閉塞性靜脈炎
綜上，Lat-Y136F敲入小鼠表現(xiàn)出IgG4-RD患者相同的免疫病理特征（Table1），這些數(shù)據(jù)支持了Lat-Y136F敲入小鼠可作為研究人類IgG4相關(guān)疾病的理想動(dòng)物模型。
Table1. IgG4-RD患者與Lat-Y136敲入小鼠的病理特征比較
南模生物L(fēng)at-Y136F小鼠模型
基于以往研究基礎(chǔ)，為方便國(guó)內(nèi)研究者對(duì)IgG4-RD進(jìn)行更加深入研究，南模生物自主重構(gòu)了Lat-Y136F模型小鼠，目前對(duì)該小鼠進(jìn)行了相關(guān)表型檢測(cè)（Fig5-7）。
Fig5. Lat-Y136F敲入小鼠的脾臟、腸系淋巴結(jié)及腹股溝淋巴結(jié)長(zhǎng)度顯著高于WT小鼠
Fig6.?Lat-Y136F敲入小鼠脾臟（左）與胸腺（右）中CD4+T細(xì)胞比例上調(diào)
Fig7. Lat-Y136F敲入小鼠脾臟中B細(xì)胞的MHCⅡ類分子表達(dá)增加
南模生物深耕基因編輯領(lǐng)域，提供全方位模式生物服務(wù)，包括基因修飾成品模型供應(yīng)、個(gè)性化模型定制、飼養(yǎng)繁育、表型分析、藥效評(píng)價(jià)等，滿足不同實(shí)驗(yàn)室需求。
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