小膠質(zhì)細(xì)胞是位于大腦中的巨噬細(xì)胞，主要負(fù)責(zé)中樞神經(jīng)系統(tǒng) (CNS) 的免疫防御，對(duì)維持大腦內(nèi)穩(wěn)態(tài)有著重要作用。

然而，由于缺乏合適的研究工具，當(dāng)前的研究方法很難區(qū)分小膠質(zhì)細(xì)胞及腦內(nèi)其它巨噬細(xì)胞，因此，人們對(duì)小膠質(zhì)細(xì)胞功能機(jī)制的深入研究受到了一定的限制。

之所以很難區(qū)分小膠質(zhì)細(xì)胞及腦內(nèi)其它巨噬細(xì)胞，是因?yàn)檫@些巨噬細(xì)胞同源，許多標(biāo)記物都相同，如整合素 α M (ITGAM/CD11b)、表面糖蛋白 F4/80、造血標(biāo)志物CD45、溶酶體蛋白CD68、離子鈣接頭分子（Iba）-1， Cx3趨化因子受體1（Cx3cr1）、MER原癌基因酪氨酸蛋白激酶（MerTK）等。

事實(shí)上，早前出現(xiàn)的Cx3cr1-Cre和Cx3cr1-CrERT2品系都是標(biāo)記所有CNS巨噬細(xì)胞，并不能區(qū)分小膠質(zhì)細(xì)胞和腦內(nèi)其它巨噬細(xì)胞。

因此，使用Cx3cr1-GFP、Cx3cr1-Cre或Cx3cr1-CrERT2品系通常將CNS中所有巨噬細(xì)胞的混合體作為整體進(jìn)行評(píng)估，而不是只針對(duì)小膠質(zhì)細(xì)胞這一類進(jìn)行研究。

此外，現(xiàn)有的轉(zhuǎn)基因品系如Sall1-GFP、Sall1-CreERT2、Cx3cr1-GFP、Cx3cr1-Cre或Cx3cr1-CreERT2通常是替代性敲入策略產(chǎn)生的，即表達(dá)外源性敲入的序列，內(nèi)源性基因不表達(dá)，但是該類策略有可能會(huì)影響小膠質(zhì)細(xì)胞的表型，因此，迫切需要新的基因工具來(lái)對(duì)小膠質(zhì)細(xì)胞進(jìn)行研究。

為此，南模生物自主研發(fā)，構(gòu)建了一種新的小膠質(zhì)細(xì)胞基因靶向模型，Tmem119-CreERT2工具小鼠，該小鼠可用于特異性研究小膠質(zhì)細(xì)胞的功能。

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早在2016年，斯坦福大學(xué)醫(yī)學(xué)院Mariko L. Bennett等人在頂尖雜志PNAS發(fā)表了一篇文章，對(duì)小膠質(zhì)細(xì)胞的特異性標(biāo)志物進(jìn)行了深入探究。

作者篩選出7個(gè)（Tmem119、Fcrls、P2ry12、P2ry13、Gpr34、Gpr84、Il1a)?候選基因，通過(guò)原位雜交，發(fā)現(xiàn)TMEM119特異性在鼠源和人源的小膠質(zhì)細(xì)胞上大量表達(dá)（Fig1），在脈絡(luò)膜叢和腦膜巨噬細(xì)胞，血管周圍細(xì)胞中均沒(méi)有表達(dá)。

另外，qPCR結(jié)果顯示TMEM119在CNS?CD45+細(xì)胞中高表達(dá)，在骨髓、脾臟、肝臟和血液中不高表達(dá)。

所有這些數(shù)據(jù)表明：TMEM119在小膠質(zhì)細(xì)胞中高表達(dá)且僅限于小膠質(zhì)細(xì)胞，TMEM119確實(shí)可以作為小膠質(zhì)細(xì)胞高度特異性的marker。隨后，TMEM119抗體被廣泛用作免疫組化方法的金標(biāo)準(zhǔn)。

Fig1. 免疫熒光檢測(cè)TMEM119在小膠質(zhì)細(xì)胞中特異性表達(dá)。

2019年，Tobias Kaiser等通過(guò)CRISPR/Cas9技術(shù)插入2A-EGFP基因盒，使得TMEM119和EGFP的表達(dá)受到內(nèi)源性Tmem119基因的控制，利用免疫熒光染色、免疫熒光成像等技術(shù)對(duì)小鼠腦組織中表達(dá)EGFP的細(xì)胞進(jìn)行分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：除小膠質(zhì)細(xì)胞外，脈絡(luò)膜叢和腦膜巨噬細(xì)胞，血管周圍細(xì)胞中均沒(méi)有EGFP的表達(dá)（Fig2. A-F）。

為了進(jìn)一步驗(yàn)證EGFP在小膠質(zhì)細(xì)胞中的特異性，作者使用了流式細(xì)胞術(shù)，通過(guò)檢測(cè)CD45+EGFP+細(xì)胞，他們確定99.6% 的細(xì)胞是對(duì)應(yīng)于小膠質(zhì)細(xì)胞的CD11b+CD45lo細(xì)胞(Fig2. H)。對(duì)2212個(gè)非小膠質(zhì)細(xì)胞CD11b+CD45int/hi進(jìn)一步檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)僅有153個(gè)細(xì)胞表達(dá)EGFP(6.9%)( Fig2. G-I)。

綜上數(shù)據(jù)表明，Tmem119-EGFP可以特異性的區(qū)分小膠質(zhì)細(xì)胞和腦內(nèi)其他巨噬細(xì)胞。

Fig2. Tmem119-EGFP 可特異性區(qū)分小膠質(zhì)細(xì)胞及腦內(nèi)其它巨噬細(xì)胞。

此外，Tobias Kaiser等科學(xué)家還證明Tmem119位點(diǎn)可被用于Tamoxifen誘導(dǎo)Cre介導(dǎo)的小膠質(zhì)細(xì)胞基因操作和小膠質(zhì)細(xì)胞的譜系追蹤，且可排除其它巨噬細(xì)胞的影響。

作者將Tmem119-CreERT2小鼠與Ai14報(bào)告小鼠進(jìn)行雜交，經(jīng)Tamoxifen處理后，對(duì)小鼠進(jìn)行免疫熒光染色。

結(jié)果發(fā)現(xiàn)，Tamoxifen誘導(dǎo)后，IBA1標(biāo)記的小膠質(zhì)細(xì)胞會(huì)表達(dá)紅色熒光 (Fig3. B-D)，未經(jīng)Tamoxifen誘導(dǎo)的小鼠則沒(méi)有tdTomato表達(dá)?(Fig3.E-G)。

另外研究還發(fā)現(xiàn)，中樞神經(jīng)系統(tǒng)的其他主要細(xì)胞類型，如少突膠質(zhì)細(xì)胞、神經(jīng)元和星形膠質(zhì)細(xì)胞中都沒(méi)有tdTomato表達(dá)?(Fig3.H-J)。

Fig3. Tmem119-CreERT2小鼠在小膠質(zhì)細(xì)胞中具有高效的重組效率。

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我們利用CRISPR/Cas9技術(shù)在Tmem119基因的終止密碼子前插入了2A-CreERT2基因盒，使得Cre重組酶具有Tmem119啟動(dòng)子特異性，且需要tamoxifen的存在才能激活。

通過(guò)將Tmem119- CreERT2與熒光報(bào)告基因小鼠基因交配發(fā)現(xiàn)，Tamoxifen誘導(dǎo)的Tmem119- CreERT2系可以在很長(zhǎng)一段時(shí)間內(nèi)對(duì)小膠質(zhì)細(xì)胞產(chǎn)生穩(wěn)定的遺傳修飾。

為了評(píng)估Tmem119-CreERT2小鼠誘導(dǎo)后在小膠質(zhì)細(xì)胞中是否有Cre活性，我們將Tmem119-CreERT2小鼠與R26-LSL-tdTomato報(bào)告小鼠進(jìn)行雜交。

實(shí)驗(yàn)表明：無(wú)Tamoxifen誘導(dǎo)的對(duì)照組中，檢測(cè)不到tdTomato的表達(dá)，只有經(jīng)Tamoxifen誘導(dǎo)后，小膠質(zhì)細(xì)胞才能夠表達(dá)tdTomato（Fig4. A-B）。

此外，在少突膠質(zhì)細(xì)胞、神經(jīng)元和星形膠質(zhì)細(xì)胞中都檢測(cè)不到tdTomato表達(dá)（Fig4.?C-D），該結(jié)果與已有報(bào)道的信息是相符的，提示該小鼠是研究小膠質(zhì)細(xì)胞研究的有力工具鼠。??

Fig4.?Tmem119-CreERT2小鼠在小膠質(zhì)細(xì)胞中具有高表達(dá)。

A. 經(jīng)Tamoxifen和玉米油分別處理，熒光檢測(cè)Tmem119-CreER；R26-tdTomato小鼠中tdTomato的表達(dá)情況。

B. 熒光檢測(cè)Tmem119-CreER；R26-tdTomato小鼠IBA1 陽(yáng)性細(xì)胞中有tdTomato的表達(dá)。

C. 熒光檢測(cè)Tmem119-CreER；R26-tdTomato小鼠小膠質(zhì)細(xì)胞（Tmem119，Tdtomato）與星形膠質(zhì)細(xì)胞（GFAP, green）共定位。

D. 熒光檢測(cè)Tmem119-CreER；R26-tdTomato小鼠小膠質(zhì)細(xì)胞（Tmem119，Tdtomato）與神經(jīng)元（NeuN, green）共定位。

（Scale bar=10μm Hippo: Hippocampus; Str: Striatum; Sn: Substantia nigra.)

綜上所述， Tmem119在小膠質(zhì)細(xì)胞高度特異性表達(dá)的特性，使其可作為區(qū)別于遺傳特征相近的CNS髓細(xì)胞和外周血中的髓細(xì)胞的marker基因/

本文構(gòu)建的可誘導(dǎo)的Tmem119-CreERT2是一個(gè)很好的體內(nèi)模型，可以在特定的時(shí)間點(diǎn)對(duì)小膠質(zhì)細(xì)胞特異性基因進(jìn)行研究，為探索小膠質(zhì)細(xì)胞開辟了新的途徑。

目前該小鼠是活體供應(yīng)的狀態(tài)，歡迎研究小膠質(zhì)細(xì)胞功能的老師咨詢及訂購(gòu)。