南模生物自主研發(fā)了TNF受體超家族各類(lèi)相關(guān)基因的敲除和人源化敲入小鼠模型，助力靶向TNF受體的藥物研發(fā)、藥物功效和安全性檢測(cè)研究。

腫瘤壞死因子受體超家族(tumor necrosis factor receptor superfamily, TNFRSF)(以下簡(jiǎn)稱TNF受體超家族)是一類(lèi)可以通過(guò)半胱氨酸富集區(qū)域(cysteine-rich domains, CRDs)與腫瘤壞死因子超家族(tumor necrosis factors superfamily, TNFSF)(以下簡(jiǎn)稱TNF超家族)結(jié)合的細(xì)胞因子受體超家族。目前已發(fā)現(xiàn)的TNF超家族蛋白有19種，TNF受體超家族蛋白有29種，廣泛表達(dá)在哺乳動(dòng)物各種組織中[1]。TNF與TNF受體結(jié)合后激活相關(guān)信號(hào)通路調(diào)控細(xì)胞增殖、細(xì)胞存活和細(xì)胞分化，促進(jìn)免疫反應(yīng)，有些結(jié)合還可以觸發(fā)細(xì)胞凋亡和其他形式的細(xì)胞死亡。

根據(jù)TNF與TNF受體結(jié)合（圖1）后是否可以誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，TNF受體超家族可分為死亡受體和非死亡受體兩類(lèi)。下面將分別介紹兩類(lèi)受體的典型分子，希望幫助大家對(duì)TNF受體超家族有更進(jìn)一步的認(rèn)識(shí)。

圖1?TNF超家族與TNF受體超家族（圖片引自知乎）

腫瘤壞死因子受體 10B?( tumor necrosis factor receptor superfamily 10B, TNFRSF10B) ，又名TNFR10B，也稱為死亡受體5?( death receptor 5，DR5)。DR5的胞外結(jié)構(gòu)域可通過(guò)與促凋亡配體Apo2L/TRAIL結(jié)合，激活細(xì)胞凋亡通路，DR5胞內(nèi)的死亡結(jié)構(gòu)域則促使DR5聚集，從而快速傳遞、放大細(xì)胞凋亡信號(hào)。DR5表達(dá)于多種癌癥細(xì)胞，腫瘤內(nèi)皮細(xì)胞，而在正常組織和細(xì)胞中表達(dá)量相對(duì)較低，DR5的配體TRAIL和激動(dòng)型單克隆抗體因此成為理想的廣譜抗腫瘤蛋白藥物[2]。此前，Yagolovich 等人制備了DR5蛋白的突變體——DR5-B，能夠比目前的TRAIL更快更有效地殺死多種腫瘤細(xì)胞，包括結(jié)腸癌細(xì)胞、人T淋巴細(xì)胞和白血病細(xì)胞[3]。創(chuàng)勝集團(tuán)旗下奕安濟(jì)世目前獲得經(jīng) InhibRx 授權(quán)的第三代死亡受體 5 (DR5)?激動(dòng)劑抗體，已由NMPA批準(zhǔn)進(jìn)入?中國(guó)1期臨床實(shí)驗(yàn)，預(yù)判在應(yīng)對(duì)目前尚無(wú)有效藥物治療的消化道腫瘤和間皮瘤等多種腫瘤方面可以作為有效的單藥療法。

TNF受體超家族11B?( tumor necrosis factor receptor superfamily 11B, TNFRSF11B )，又名TNFR11B，也稱為護(hù)骨素( osteoprotegerin, OPG)?、破骨細(xì)胞形成抑制因子(OCIF)， 主要在成骨細(xì)胞中表達(dá)[4]。臨床研究表明OPG基因的多態(tài)性和骨密度相關(guān)。老年人多容易出現(xiàn)骨密度和骨質(zhì)量的下降的現(xiàn)象，這造成了骨微結(jié)構(gòu)的破壞，增加了骨脆性，從而容易發(fā)生骨折，這樣的全身性骨病即是骨質(zhì)疏松癥?(osteoporosis)。OPG全身敲除的小鼠，具有典型的骨質(zhì)疏松癥和動(dòng)脈鈣化的表型（簡(jiǎn)稱“骨質(zhì)疏松小鼠”），可以為“人類(lèi)骨質(zhì)疏松癥”治療藥物的篩選和評(píng)價(jià)、骨質(zhì)疏松基因治療、破骨細(xì)胞和成骨細(xì)胞的相互作用機(jī)制等研究提供理想的動(dòng)物模型和新型研究手段，具有重要的理論意義和應(yīng)用價(jià)值[5]。

腫瘤壞死因子受體2?(Tumor necrosis factor receptor superfamily 2, TNFRSF2)，也叫TNFR2，CD120b或者p75。TNFR2的表達(dá)僅限于抑制性免疫細(xì)胞，尤其是調(diào)節(jié)性T細(xì)胞?(Tregs)和髓系抑制性細(xì)胞?(MDSCs)。此外，TNFR2也在腫瘤細(xì)胞中表達(dá)[6]。TNFR2主要起到免疫抑制作用，因此具有高免疫抑制力的TNFR2⁺?Tregs細(xì)胞會(huì)被招募到腫瘤微環(huán)境中，從而促進(jìn)腫瘤免疫逃逸。TNFR2基因敲除小鼠對(duì)腫瘤表現(xiàn)出增強(qiáng)的免疫應(yīng)答，腫瘤生長(zhǎng)放緩。這可能是由于缺乏TNFR2⁺?Treg，或未能發(fā)展出全身性自身免疫，或MDSC數(shù)量減少和功能受損[7]。因此，利用TNFR2拮抗劑抑制Tregs，恢復(fù)腫瘤免疫應(yīng)答并消除腫瘤，成為了腫瘤免疫治療的新策略。

腫瘤壞死因子受體4?(tumor necrosis factor receptor superfamily 4, TNFRSF4)，又名TNFR4，也稱為OX40，是I型跨膜蛋白質(zhì)，主要表達(dá)于活化的CD4⁺、CD8⁺?和調(diào)節(jié)性T細(xì)胞中[8-9]。OX40-OX40L（圖2）信號(hào)可以阻斷Tregs抑制T細(xì)胞以及減少Tregs生成的能力，也可通過(guò)抑制Tregs的免疫抑制效應(yīng)并限制其種群，進(jìn)一步擴(kuò)大T細(xì)胞活化效應(yīng)[9]。抗OX-40的應(yīng)用增加了外周血CD4⁺和CD8⁺?T細(xì)胞的增殖，增加了召回幼稚T細(xì)胞的反應(yīng)，并增加了內(nèi)源性腫瘤特異性免疫反應(yīng)。

目前，OX40已成為新藥研發(fā)領(lǐng)域的熱門(mén)靶點(diǎn)之一，全球已經(jīng)有十余款OX40抗體邁入臨床階段，包括信達(dá)生物、輝瑞、阿斯利康、百時(shí)美施貴寶等公司均有涉足這一領(lǐng)域，研究進(jìn)展較快的已經(jīng)進(jìn)入2期臨床。

圖2 OX40-OX40L complex

腫瘤壞死因子受體5?( tumor necrosis factor receptor superfamily 5, TNFRSF5) ，又名TNFR5，也稱為CD40，是I型跨膜蛋白質(zhì)，主要在成熟和激活的 B 細(xì)胞中表達(dá)，同時(shí)也在抗原呈遞細(xì)胞中表達(dá)。CD40-CD40L結(jié)合后，招募TNFR相關(guān)因子促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)，參與機(jī)體的體液免疫和細(xì)胞免疫反應(yīng)[10-11]。例如，CD4+?T細(xì)胞通過(guò)CD40L-CD40結(jié)合激活樹(shù)突細(xì)胞 (dendritic cell, DC)，激活后的DC可促進(jìn)T細(xì)胞分化，引發(fā)有效的CTL (cytotoxic T cell, CTL)反應(yīng)。CD4⁺輔助T細(xì)胞則在獲得DC呈遞的pMHC-I，變成CD4⁺?Th-APC，導(dǎo)致CD4⁺?T-CD8⁺?T細(xì)胞通過(guò)CD40L-CD40直接相互作用，刺激CD8⁺?CTL的增殖和記憶形成。在CD40靶點(diǎn)的藥物開(kāi)發(fā)上，羅氏、艾伯維、Apexigena、Celldex和Alligator Biosciences均有涉足，目前處于領(lǐng)先的是Apexigen的APX005，處于II期臨床階段，而Alligator的Mitazalimab產(chǎn)品在不同的癌癥治療的臨床試驗(yàn)中也有比較積極的反饋。

總之，TNF超家族-TNF受體超家族參與了多種人類(lèi)疾病的發(fā)生發(fā)展，如骨質(zhì)疏松癥、免疫系統(tǒng)疾病和腫瘤等[1]，并且靶向TNF受體超家族的治療疾病的方法已被廣泛報(bào)道。在腫瘤臨床治療領(lǐng)域，通過(guò)調(diào)控TNFR2、CD27、CD40、OX40、BCMA、4-1BB等TNF受體超家族成員發(fā)揮抗癌作用，已成為免疫療法的新高地。目前，針對(duì)以上靶點(diǎn)的藥物研發(fā)正在如火如荼地進(jìn)行，但是暫時(shí)還沒(méi)有藥物上市，這一領(lǐng)域仍大有可為。

南模為助力TNF受體超家族研究以及腫瘤藥物研發(fā)，自主研發(fā)了一系列的TNF受體超家族小鼠模型，以下是詳細(xì)品系列表。

表1 南模生物腫瘤壞死因子受體超家族模型資源庫(kù)

模型一：Tnfrsf11b（Opg）基因敲除小鼠模型的驗(yàn)證

X-Ray檢測(cè)Opg基因純合缺失小鼠的骨密度變化，與野生型小鼠相比，Opg^-/-小鼠的股骨發(fā)生骨質(zhì)疏松(圖3a,b)。HE染色結(jié)果顯示，與野生型小鼠相比，Opg敲除小鼠在主動(dòng)脈出現(xiàn)動(dòng)脈鈣化，其特點(diǎn)是沒(méi)有動(dòng)脈粥樣斑塊形成，只是出現(xiàn)動(dòng)脈中膜鈣化（圖3c, d）。

圖3?Opg^-/-小鼠表現(xiàn)出骨質(zhì)疏松和主動(dòng)脈鈣化

TRAP染色檢測(cè)股骨皮質(zhì)軸的TRAP陽(yáng)性的破骨細(xì)胞，與野生型小鼠相比，Opg^-/-小鼠的股骨含有較多的破骨細(xì)胞，具有更快的骨質(zhì)代謝速度（圖4a，b）。HE染色檢測(cè)破骨細(xì)胞形態(tài)，與野生型小鼠相比，骨表面的破骨細(xì)胞呈現(xiàn)出更明顯的立方形（圖4c，d）。

圖4?Opg^-/-高速骨質(zhì)更新

模型二：OX40人源化小鼠模型（OX40-HU）的驗(yàn)證

2020年2月，信達(dá)生物關(guān)于IBI101研發(fā)的文章發(fā)表在Cancer Immunology, Immunotherapy期刊上，文章題目為“Development and characterization of a novel anti-OX40 antibody for potent immune activation”。

該項(xiàng)研究中的OX40小鼠是由南模生物提供。靶向OX40的抗體藥物或聯(lián)合用藥后，具有良好的抑制腫瘤生長(zhǎng)、提高腫瘤浸潤(rùn)淋巴細(xì)胞比例和細(xì)胞因子釋放淋巴細(xì)胞比例的作用（圖5）。

圖5 OX40人源化小鼠MC38 荷瘤模型體內(nèi)抗腫瘤藥效驗(yàn)證及CD8⁺?T細(xì)胞應(yīng)答情況。

注：a 顯示的是OX40陽(yáng)性抗體藥物IBI101單藥或聯(lián)合用藥后的腫瘤生長(zhǎng)曲線。箭頭所示為給藥節(jié)點(diǎn)。b顯示的是在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中小鼠體重情況。c和d顯示的是分別給小鼠用藥后，收集腫瘤(c)和脾臟(d)并通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)分析各類(lèi)淋巴細(xì)胞的比例。e和f顯示的是流式檢測(cè)腫瘤(e)和脾臟(f)(n≥5)T細(xì)胞針對(duì)腫瘤釋放相應(yīng)細(xì)胞因子的比例。

模型三：CD40人源化小鼠模型（CD40-HU）的驗(yàn)證

CD40 人源化純合子小鼠和野生型小鼠外周血細(xì)胞FACS 檢測(cè)，結(jié)果顯示CD40人源化純合子小鼠CD19 陽(yáng)性細(xì)胞中可以檢測(cè)到人源CD40 的活躍表達(dá)，其表達(dá)量與野生型小鼠鼠源Cd40 的表達(dá)類(lèi)似（圖6）。

圖6 FACs檢測(cè)CD40 人源化小鼠外周血細(xì)胞CD40 表達(dá)。

CD40 人源化小鼠接種MC38 結(jié)腸癌細(xì)胞系，腫瘤生長(zhǎng)至約100 mm3隨機(jī)將動(dòng)物隨機(jī)分組（n=8）給藥。結(jié)果顯示針對(duì)人的CD40 陽(yáng)性藥物有非常顯著的抗腫瘤效果（p<0.001）；針對(duì)PD-1 和CD40 的抗體藥物聯(lián)合用藥有更明顯的抗腫瘤效果（圖7）。

圖7 CD40 人源化小鼠MC38 荷瘤模型體內(nèi)抗腫瘤藥效驗(yàn)證

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