南模生物模型鼠助力王福俤/閔軍霞等團隊研究獲得新突破
Blood: 南模助力王福俤/閔軍霞/鄭樹森院士團隊在肝纖維化及肝硬化防治領(lǐng)域獲得重大突破
肝臟纖維化是多種致病原因所致的慢性肝臟損傷后發(fā)生的肝內(nèi)結(jié)締組織異常增生性疾病，長期發(fā)展會導致肝硬化，是一種世界范圍內(nèi)較為常見的致死病因。目前，除肝臟移植外，針對肝纖維化及肝硬化尚缺乏有效治療措施【2】。
因此，早期發(fā)現(xiàn)及預防肝損傷、肝纖維化及肝硬化的發(fā)生對于改善肝臟疾病的轉(zhuǎn)歸及預后至關(guān)重要。
近日，國際權(quán)威學術(shù)期刊《血液學》(Blood，影響因子16.6)在線發(fā)表了浙江大學醫(yī)學院王福俤教授、閔軍霞教授和鄭樹森院士團隊合作研究新成果。
論文題目為 “Hepatic Transferrin Plays a Role in Systemic Iron Homeostasis and Liver Ferroptosis”【1】（圖1）。
該成果系統(tǒng)揭示并闡明肝臟轉(zhuǎn)鐵蛋白（Transferrin, Trf）通過調(diào)控鐵死亡抑制肝臟損傷、纖維化及肝硬化發(fā)生的功能及致病分子機制。
圖1. Online發(fā)表論文首頁
南模生物為該研究構(gòu)建了Trffl/+小鼠模型。
該研究通過在國際上率先構(gòu)建的肝實質(zhì)細胞特異敲除轉(zhuǎn)鐵蛋白基因的小鼠模型，展現(xiàn)出機體組織鐵蓄積、鐵死亡及肝纖維化的系列典型病理特征；并進一步功能篩選發(fā)現(xiàn)金屬膜蛋白Slc39a14（Zip14）是轉(zhuǎn)鐵蛋白缺失引發(fā)的組織器官鐵蓄積的關(guān)鍵轉(zhuǎn)運蛋白；闡明敲除Slc39a14能夠完全逆轉(zhuǎn)非轉(zhuǎn)鐵蛋白結(jié)合鐵（NTBI）蓄積以及肝細胞鐵過載導致的肝細胞鐵死亡和肝纖維化。
該重大研究成果不僅為防治肝損傷、肝纖維化及肝硬化等疾病提供了新靶點（轉(zhuǎn)鐵蛋白及Slc39a14），而且為進一步深入研究肝纖維化及肝硬化的致病機制提供了新思路。
為了研究轉(zhuǎn)鐵蛋白在肝臟組織中的功能，研究者首先利用Cre/loxP技術(shù)構(gòu)建了編碼轉(zhuǎn)鐵蛋白（Transferrin, Trf）基因的肝實質(zhì)細胞特異性敲除小鼠（Trf-LKO）。研究發(fā)現(xiàn)肝實質(zhì)細胞特異敲除Trf后，小鼠鐵調(diào)素Hepcidin表達水平下降，全身鐵代謝發(fā)生明顯紊亂；小鼠主要表現(xiàn)為造血異常、血清中NTBI水平急劇升高同時伴隨肝臟中鐵離子蓄積，并在6-12月齡時觀察到肝臟脂質(zhì)過氧化損傷。
進一步在高鐵飼喂以及慢性四氯化碳注射的兩種常用肝纖維化動物模型中，研究者們發(fā)現(xiàn)肝實質(zhì)細胞特異性敲除Trf小鼠出現(xiàn)嚴重肝纖維化的表現(xiàn)，并伴隨肝臟脂質(zhì)過氧化損傷增強、鐵死亡調(diào)控基因表達異常。
這些數(shù)據(jù)提示鐵死亡在低轉(zhuǎn)鐵蛋白相關(guān)的肝纖維化發(fā)生中可能發(fā)揮作用。
圖2: 肝臟Trf敲除小鼠發(fā)生肝纖維化
進一步探索機制過程中，研究人員給上述疾病模型小鼠腹腔注射鐵死亡抑制劑Ferrostatin-1（Fer-1），發(fā)現(xiàn)Fer-1治療組小鼠的肝纖維化表型明顯緩解，表明細胞鐵死亡是低轉(zhuǎn)鐵蛋白相關(guān)的肝纖維化發(fā)生的關(guān)鍵致病機制。
圖3.鐵死亡抑制劑有效逆轉(zhuǎn)肝臟纖維化
接下來的關(guān)鍵科學問題是：在肝臟缺乏轉(zhuǎn)鐵蛋白時，為什么NTBI會進入肝臟并在肝臟蓄積？
通過對Trf-LKO小鼠金屬轉(zhuǎn)運蛋白的篩選，研究人員鎖定金屬離子轉(zhuǎn)運蛋白Slc39a14。有趣的是，王福俤團隊前期曾報道該蛋白在生理條件下主要轉(zhuǎn)運錳離子【3】。
為明確這一關(guān)鍵問題，研究團隊在國際上首次成功制備了肝實質(zhì)細胞特異性敲除Trf和Slc39a14的雙基因敲除小鼠模型(DKO)，并且驚喜地發(fā)現(xiàn)，抑制Slc39a14的表達能明顯改善肝臟NTBI的蓄積，并顯著減輕脂質(zhì)過氧化及鐵死亡引發(fā)的肝損傷，從而成功逆轉(zhuǎn)了肝實質(zhì)細胞Trf敲除小鼠的鐵死亡及其誘發(fā)的肝纖維化。
這些結(jié)果不僅進一步明確了NTBI蓄積是誘發(fā)肝臟鐵死亡的分子機制，同時提示Slc39a14有望成為治療低轉(zhuǎn)鐵蛋白及鐵死亡相關(guān)肝臟疾病的重要靶點。
圖4.肝實質(zhì)細胞特異敲除Slc39a14逆轉(zhuǎn)Trf缺失導致的肝臟纖維化
小鼠的這些系列發(fā)現(xiàn)是否與臨床相關(guān)疾病有關(guān)？為了進一步探究臨床患者轉(zhuǎn)鐵蛋白與肝纖維化關(guān)聯(lián)特征，研究人員通過分析肝硬化患者和正常健康對照的血清學指標，發(fā)現(xiàn)肝硬化患者的血清轉(zhuǎn)鐵蛋白水平顯著低于健康對照人群；并且肝硬化患者的肝纖維化四項與血清轉(zhuǎn)鐵蛋白水平之前存在顯著負相關(guān)。
這些臨床相關(guān)分析進一步提示轉(zhuǎn)鐵蛋白缺乏在肝纖維化/肝硬化的發(fā)生發(fā)展中可能扮演重要角色。
此外，基于肝硬化患者的肝穿樣本的檢測結(jié)果，發(fā)現(xiàn)肝硬化患者的肝臟轉(zhuǎn)鐵蛋白水平明顯減少，而肝臟鐵水平及SLC39A14蛋白表達水平明顯增高，進一步表明轉(zhuǎn)鐵蛋白缺乏的肝纖維化/肝硬化患者可能通過SLC39A14吸收NTBI，隨后激發(fā)了脂質(zhì)過氧化性肝損傷、肝纖維化及肝硬化。這些數(shù)據(jù)提示抑制鐵死亡或SLC39A14有望成為潛在的防治肝硬化的治療方式。
圖5. 肝硬化患者轉(zhuǎn)鐵蛋白缺乏及脂質(zhì)過氧化損傷
結(jié)論
總之，該重大成果的主要突出貢獻為：
（1）首次成功制備轉(zhuǎn)鐵蛋白組織特異性敲除小鼠模型，為研究轉(zhuǎn)鐵蛋白的組織來源及功能提供新型動物模型；
（2）闡明了肝臟轉(zhuǎn)鐵蛋白缺乏通過鐵死亡促發(fā)肝纖維化的分子機制；
（3）首次明確SLC39A14是組織器官鐵離子過載的轉(zhuǎn)運蛋白，解析了困擾科學界半個多世紀的難題；
（4）闡明補充轉(zhuǎn)鐵蛋白以及抑制鐵死亡或SLC39A14能夠有效預防及緩解肝纖維化發(fā)生發(fā)展，為肝纖維化及肝硬化的防治提供了重要新靶點。
該成果不僅豐富和闡明肝臟疾病鐵死亡發(fā)生的分子調(diào)控機制，同時為肝臟疾病診治提供了新靶點和新策略。
圖6.論文模式圖
Advanced Science：南模助力王福俤/閔軍霞/謝黎煒團隊合作揭示轉(zhuǎn)鐵蛋白受體調(diào)控脂肪細胞產(chǎn)熱及細胞命運的新機制
脂肪組織是參與調(diào)控全身能量代謝的重要器官，主要由三種脂肪細胞構(gòu)成：白色、棕色和米色。白色脂肪用于貯存能量，而棕色脂肪用于消耗能量，通過非戰(zhàn)栗性產(chǎn)熱來維持體溫恒定。活化棕色脂肪有助于機體抵抗能量攝入過多引起的脂肪堆積，從而抑制肥胖的發(fā)生[5]。米色脂肪是近年來新發(fā)現(xiàn)可以被冷刺激或β3-腎上腺素受體激動劑誘導形成的一種產(chǎn)熱脂肪，在治療肥胖及相關(guān)代謝性疾病方面有極好的應用前景[6]。
通過深入了解白色脂肪米色樣變及棕色脂肪形成和活化的分子調(diào)控機制，對于靶向干預促進棕色/米色脂肪產(chǎn)熱具有重要的理論和實踐意義。
微量元素鐵在維持營養(yǎng)和能量代謝平衡中扮演重要角色[7]。脂肪細胞鐵穩(wěn)態(tài)代謝的研究多集中在白色脂肪。在白色脂肪細胞分化過程中，通過DFO螯合細胞中鐵離子或者敲降轉(zhuǎn)鐵蛋白（Tf）可以顯著抑制脂合成[8]；添加鐵和Tf可以促進脂肪細胞脂解[9]，抑制胰島素刺激的葡萄糖吸收[10]。
遺傳性低鐵模型Tmprss6敲除小鼠脂肪組織鐵含量減少，白色脂肪脂解增加，從而抵抗高脂膳食誘導的肥胖[11]。然而，鐵穩(wěn)態(tài)代謝對棕色脂肪細胞分化產(chǎn)熱以及白色脂肪米色化的調(diào)控作用及其分子機制尚待深入研究。
4月24，來自浙江大學醫(yī)學院王福俤和閔軍霞團隊，以及廣東省微生物研究所謝黎煒團隊在國際著名學術(shù)期刊Advanced Science（影響因子15.804）發(fā)表題為“Transferrin Receptor 1 Regulates Thermogenic Capacity and Cell Fate in Brown/Beige Adipocytes”的研究論文[4]。表明轉(zhuǎn)鐵蛋白受體(Transferrin Receptor 1, Tfr1)通過特異機制調(diào)控棕色/米色脂肪細胞功能和發(fā)育。在米色脂肪形成過程中，活化的缺氧誘導因子HIF1α通過轉(zhuǎn)錄調(diào)控Tfr1表達促進鐵吸收從而維持線粒體功能；在棕色脂肪發(fā)育過程中，Tfr1以非鐵依賴的方式調(diào)控棕色脂肪與白色脂肪、肌細胞的轉(zhuǎn)分化。
南模生物為該研究構(gòu)建了Tmprss6fl/fl小鼠模型。
研究人員在β3腎上腺素激動劑CL-316,243誘導米色脂肪形成的小鼠模型上，通過H3K9/14Ac ChIP-seq、RNA-seq和iTRAQ膜蛋白質(zhì)組等多種組學技術(shù)發(fā)現(xiàn)鐵穩(wěn)態(tài)代謝被明顯富集，并篩選出轉(zhuǎn)鐵蛋白受體Tfr1表達顯著上調(diào)。
隨后發(fā)現(xiàn)Tfr1脂肪特異性敲除（Tfr1Adp/Adp）小鼠對冷不耐受，冷誘導的米色脂肪細胞形成被抑制，冷誘導的棕色脂肪產(chǎn)熱和脂解減少，線粒體形態(tài)和鐵穩(wěn)態(tài)代謝異常（圖一）。
圖1：Tfr1脂肪特異性敲除小鼠棕色/米色脂肪功能異常
在高脂膳食（HFD）誘導的肥胖模型下，Tfr1敲除雖然不影響食欲和體重，但是可加劇HFD誘導的脂代謝紊亂、胰島素抵抗和脂肪組織炎癥。
隨后，研究人員對米色脂肪形成過程中Tfr1表達上調(diào)的分子機制進行了研究，發(fā)現(xiàn)缺氧誘導因子HIF1α蛋白表達和入核活化明顯增加，棕色脂肪特異性敲除Hif1α （Hif1aUcp1/Ucp1）小鼠表現(xiàn)出冷誘導的米色脂肪生成被抑制，而棕色脂肪卻未見明顯改變。
通過Chip-qPCR實驗發(fā)現(xiàn)冷刺激可以誘導米色脂肪HIF1α與Tfr1 啟動子結(jié)合促進其轉(zhuǎn)錄。
以上結(jié)果提示冷刺激誘導HIF1α活化，通過轉(zhuǎn)錄調(diào)控Tfr1表達控制鐵吸收從而促進白色脂肪米色化。
為了解析Tfr1敲除導致棕色脂肪功能異常的機制，研究人員通過轉(zhuǎn)錄組分析發(fā)現(xiàn)Tfr1敲除可以明顯增加干細胞、白色脂肪細胞和肌細胞標志基因表達，并對這些基因表達進行驗證。從而表明Tfr1在棕色脂肪細胞命運決定中扮演重要角色。
然而這一作用與Tfr1敲除造成的低鐵狀態(tài)無關(guān)，因為無論是遺傳性低鐵（Tmprss6-/-）小鼠模型還是孕期低鐵飼喂均不能模擬Tfr1敲除引起的棕色脂肪細胞向肌細胞轉(zhuǎn)分化，表明Tfr1可能通過非鐵依賴的作用調(diào)控棕色脂肪細胞分化。
然而Tmprss6-/-小鼠冷誘導的米色脂肪生成被抑制，表明鐵穩(wěn)態(tài)在白色脂肪米色化過程中起重要作用。Tfr1如何通過鐵依賴與非鐵依賴作用調(diào)控棕色/米色脂肪細胞產(chǎn)熱和分化仍待進一步研究。
圖2：Tfr1調(diào)控棕色/米色脂肪細胞產(chǎn)熱和分化的模式圖
結(jié)論
總之，該成果發(fā)現(xiàn)Tfr1和鐵穩(wěn)態(tài)代謝在調(diào)控棕色和米色脂肪細胞產(chǎn)熱和命運決定中的關(guān)鍵作用，并從機制上揭示了冷刺激誘導活化的HIF1α通過轉(zhuǎn)錄調(diào)控Tfr1促進白色脂肪米色化，這一重大發(fā)現(xiàn)將為脂肪細胞生理和機體鐵穩(wěn)態(tài)代謝提供新的認識，為肥胖及相關(guān)代謝性疾病機制探索和靶向治療提供新的方向和思路。
以上內(nèi)容轉(zhuǎn)自公眾號營養(yǎng)發(fā)現(xiàn)
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