從名字就能知道這套系統(tǒng)的兩個主要組成部分：

Cre重組酶

環(huán)化重組酶（Cre, cyclization recombinase），是酪氨酸位點特異性重組酶之一，能催化兩個DNA識別位點之間的位點特異性重組。Cre重組酶來源于P1噬菌體，由 343個氨基酸組成，能特異性地識別Lox位點。除Cre以外，此類重組酶還有Flp（flipase）和Dre（D6特異性重組酶）。

Lox位點

Cre重組酶識別的回文DNA位點，也叫l(wèi)oxP (locus of X-over P1) 位點，長 34bp，其特征結(jié)構(gòu)為ATAACTTCGTATA?-NNNTANNN-TATACGAAGTTAT。兩邊反向互補(bǔ)的13個堿基為Cre重組酶的識別序列，中間的8個堿基為重組發(fā)生位置，這也決定了loxP的方向。N表示可變堿基，不同的堿基選擇可形成不同的 Lox位點，除了野生型loxP，常見的還有 Lox2272，Lox511，Lox5171等等，這些突變Lox位點也能被Cre重組酶識別，但是只有兩個序列相同的Lox位點之間才能發(fā)生重組。

圖1 . loxP位點及其突變體位點。（圖片來自Ref.1）

在同一個 DNA 分子上，根據(jù)Lox位點的位置與方向，可能會發(fā)生3種不同的重組事件：

（1）切除：當(dāng)兩個Lox位點在同一染色體上且方向相同時，將切除同向Lox位點之間的DNA序列（也叫Lox側(cè)翼序列，F(xiàn)lox序列）。

（2）反轉(zhuǎn)：當(dāng)兩個Lox位點位于同一染色體上且方向相反時，兩個Lox位點之間的序列發(fā)生序列反轉(zhuǎn)，即顛倒。

（3）易位：如果兩個Lox位點位于不同的染色體上且方向相同，則易位事件將導(dǎo)致DNA片段的交換。

圖2. Cre的重組機(jī)制。A）loxP位點的基本結(jié)構(gòu)。紅色箭頭指示loxP位點的方向。B）Cre-loxP介導(dǎo)的易位重組。C）左圖示Cre介導(dǎo)兩同向loxP位點間的切除重組。右圖示Cre介導(dǎo)兩反向loxP位點間的反轉(zhuǎn)重組。（圖片來自Ref.2）

利用Cre-lox系統(tǒng)在小鼠體內(nèi)實現(xiàn)對基因的時空特異性打靶（表達(dá)或敲除），原則上需要建立兩種小鼠。

首先，建立特異性Cre小鼠，該小鼠中的Cre重組酶由特定啟動子驅(qū)動，可在特定細(xì)胞或組織或全身表達(dá)Cre重組酶。Cre重組的特異性由驅(qū)動Cre的啟動子或增強(qiáng)子控制。

其次，需要建立Flox小鼠，即在該小鼠靶基因序列側(cè)翼帶有Lox位點。將上述兩種小鼠雜交繁育，子代中可以獲得既帶有Cre又帶有Flox基因的小鼠，即條件性基因打靶（表達(dá)或敲除靶基因）小鼠。

在小鼠中， Cre-lox系統(tǒng)最初被用于在特定細(xì)胞群中打開基因的表達(dá)。條件性基因表達(dá)所需要的Flox小鼠，一般帶有一個沉默的轉(zhuǎn)基因，也就是說在靶基因與啟動子之間有一個“終止盒”（lox-stop-lox）。這個“終止盒”通常由強(qiáng)polyA信號和/或剪接供體序列構(gòu)成，能阻止轉(zhuǎn)基因的轉(zhuǎn)錄。這些Flox小鼠與細(xì)胞類型特異性表達(dá)Cre的轉(zhuǎn)基因小鼠交配后獲得的子代小鼠中，在每個表達(dá)Cre重組酶的細(xì)胞中，終止盒被Cre切除，因此僅在這些細(xì)胞中表達(dá)所需的轉(zhuǎn)基因。

圖3. 條件性基因表達(dá)小鼠原理示意圖。（圖片來自Ref.3）

條件性基因敲除所需要的Flox小鼠，一般在需要切除的DNA片段兩側(cè)帶有同方向的兩個Lox位點（lox-GENE-lox）。與細(xì)胞類型特異性Cre小鼠交配后，Cre 重組酶會識別Lox位點，導(dǎo)致靶基因被敲除。由于 Cre 基因的表達(dá)受上游啟動子的調(diào)控，因此啟動子的時空特異性就決定了基因重組的時空特異性。

圖4. 條件性基因敲除小鼠原理示意圖。（圖片來自Ref.3）

為了能夠更準(zhǔn)確地進(jìn)行遺傳功能研究，時間特異性的Cre-lox（也叫誘導(dǎo)型Cre-lox）被開發(fā)出來，可用于研究生物體發(fā)育過程特定階段的基因功能，或用來進(jìn)行譜系示蹤等。常用誘導(dǎo)型Cre-lox系統(tǒng)有：

也叫他莫昔芬（Tam）誘導(dǎo)的Cre系統(tǒng)。將Cre與雌激素受體ER融合，可通過他莫昔芬（Tam）誘導(dǎo)Cre的重組活性。在沒有他莫昔芬的情況下，CreER融合蛋白與熱休克蛋白90（HSP90）相互作用并存在于細(xì)胞質(zhì)中（圖5.1）。給予他莫昔芬藥物處理會破壞HSP90與CreER的相互作用（圖5.2）。ER與Tam的相互作用誘導(dǎo)Cre的核易位（圖5.3）。在細(xì)胞核中，CreER識別loxP位點（圖5.4）并使組織X中的基因Y失活（圖5.5）。CreERT2在體內(nèi)對藥物誘導(dǎo)的敏感性更高，因此一般優(yōu)選使用CreERT2。

圖5. 他莫昔芬（Tam）誘導(dǎo)的Cre系統(tǒng)。（圖5-7來自Ref.4）

四環(huán)素誘導(dǎo)系統(tǒng)，也叫強(qiáng)力霉素（Dox，四環(huán)素衍生物）誘導(dǎo)的Cre系統(tǒng)。該系統(tǒng)有兩種模式：Tet-on和Tet-off，分別是Dox依賴性Cre的激活和Dox依賴性Cre的失活。Tet系統(tǒng)包括以下元件：反向四環(huán)素控制反式激活因子（rtTA）；四環(huán)素控制反式激活因子（tTA）；四環(huán)素響應(yīng)元件（TRE），通常是19個核苷酸的四環(huán)素操縱子（tetO）序列的7個重復(fù)，調(diào)節(jié)Cre基因的表達(dá)。Dox通常在小鼠的飼料或飲水中進(jìn)行給藥。

Cre;Tet-on系統(tǒng)

在Tet-on系統(tǒng)中，表達(dá)普遍存在的或組織特異性的啟動子驅(qū)動的rtTA。在沒有Dox的情況下，失活的rtTA無法與負(fù)責(zé)調(diào)控Cre基因的TRE序列結(jié)合，則Cre不表達(dá)。在Dox給藥之后，Dox結(jié)合并激活rtTA。激活的rtTA與TRE序列結(jié)合并誘導(dǎo)Cre表達(dá)。

圖6. Dox誘導(dǎo)的Cre;Tet-on系統(tǒng)。Dox給藥才能打開Cre表達(dá)。

Cre;Tet-off系統(tǒng)

另一方面，在Tet-off系統(tǒng)中，在沒有Dox的情況下，激活的tTA能夠結(jié)合Cre前的TRE序列并誘導(dǎo)Cre表達(dá)。而在Dox給藥后，與Dox相互作用的tTA被滅活。滅活的rTA不再與TRE結(jié)合，因此Cre表達(dá)受到抑制。

圖7. ?Dox誘導(dǎo)的Cre;Tet-off系統(tǒng)。Dox給藥后關(guān)閉Cre表達(dá)。

早期Cre小鼠的建立主要通過隨機(jī)轉(zhuǎn)基因的方式，將外源特異性啟動子連同Cre基因序列隨機(jī)地整合到小鼠基因組中。這些隨機(jī)轉(zhuǎn)基因方法雖然可以篩選到細(xì)胞特異性表達(dá)的Cre小鼠品系，但是由于Cre整合的隨機(jī)位點和基因拷貝數(shù)的不可控，Cre重組酶的表達(dá)很可能會受到染色體狀態(tài)的影響，如DNA甲基化導(dǎo)致Cre的沉默。

因此，更為可靠的方法是通過基因打靶（ES細(xì)胞同源重組或CRISPR/Cas9途徑）的方式將單拷貝的Cre基因定點整合到內(nèi)源基因座中，受內(nèi)源基因表達(dá)調(diào)控。

這樣一般有以下3種做法：

（1）Cre表達(dá)框直接插入到內(nèi)源基因起始密碼子前；

（2）Cre連接在2A自剪切序列之后，插入到內(nèi)源基因終止密碼子位置；

（3）Cre連接在內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點（IRES）之后，插入到內(nèi)源基因終止密碼子之后。

第一種做法（1）在表達(dá)Cre重組酶的同時會破壞內(nèi)源基因的表達(dá)。有些基因的雜合子和純合子表達(dá)基因量不同導(dǎo)致下游信號強(qiáng)度差異。第三種做法（3），IRES介導(dǎo)的翻譯通常會導(dǎo)致Cre的表達(dá)強(qiáng)度衰減。此外，應(yīng)盡可能避免破壞內(nèi)源基因3‘UTR，防止影響表達(dá)后修飾。因此，在建立新的Cre小鼠時，測試并記錄新Cre小鼠中Cre的表達(dá)模式是非常有必要的。

圖8. ?Cre表達(dá)框直接插入到內(nèi)源基因起始密碼子前，在表達(dá)Cre重組酶的同時會破壞內(nèi)源基因的表達(dá)。

圖9. 將Cre基因定點敲入到內(nèi)源基因的3‘端，建立共表達(dá)Cre小鼠。

通常我們會利用Reporter小鼠與Cre小鼠雜交來驗證Cre的表達(dá)譜。Reporter小鼠一般是在Rosa26位點插入帶有l(wèi)ox-stop-lox終止盒以及報告基因（LSL-R）的一種工具小鼠，只有Cre酶介導(dǎo)重組切除終止盒后，才會有報告基因的表達(dá)。例如需要驗證GeneX-Cre定點整合小鼠，可將Cre雜合子小鼠（GeneXCre/wt）與Reporter雜合子（Reporter?lox/wt）或純合子（Reporterlox/lox）小鼠交配，通過免疫組化、免疫熒光或原位雜交來判斷Cre陽性的子代小鼠(GeneXCre/wt?; Reporter?lox/wt)報告基因是否在已知表達(dá)GeneX的細(xì)胞中表達(dá)，從而了解Cre的特異性表達(dá)是否與預(yù)期的一致。

圖10. 用Reporter小鼠驗證Cre小鼠示意圖。（圖片來自Ref.6）

Cre重組酶的重組效率并不是100%的，也就是說當(dāng)Cre小鼠與flox小鼠交配后，特定組織中只有部分細(xì)胞中發(fā)生重組，因此會產(chǎn)生嵌合模式。

lox位點的放置位置會影響重組效率。只有兩個lox位點相遇才能在Cre作用下發(fā)生位點特異性重組，而兩個lox位點相距越遠(yuǎn)，它們相遇的概率就越低，導(dǎo)致重組效率也就越低。因此，在設(shè)計條件性基因打靶策略時，需要考慮基因結(jié)構(gòu)與flox區(qū)域的長度，來降低重組失敗的風(fēng)險。

Cre的表達(dá)量并不等同于Cre對lox位點的重組效率。很多時候由于基因組調(diào)控的復(fù)雜性，以及每個基因在不同細(xì)胞內(nèi)染色質(zhì)狀態(tài)不同，Cre對于不同基因位點的Loxp切割效率并不一致。甚至有可能會出現(xiàn)同一種Cre小鼠對一種flox基因起作用，對另一種flox基因則不起作用的極端情況。而在使用Reporter小鼠指示Cre活性時，由于Reporter小鼠中l(wèi)ox位點與報告基因所在的基因組狀態(tài)偏開放，從而使得Cre在Reporter小鼠中重組的效率會比對實際目標(biāo)lox位點的重組效率要高一些。因此，Reporter小鼠驗證的結(jié)果可以作為一種參考，但不是金標(biāo)準(zhǔn)。可以用多種不同的Reporter小鼠來檢測Cre小鼠的特異性重組,反映出Cre重組酶對不同基因的重組效率可能是不同的。

使用細(xì)胞特異性啟動子控制Cre的表達(dá)可實現(xiàn)目標(biāo)基因的選擇性失活、激活或突變。通常我們希望Cre重組酶受啟動子限制，僅在小鼠的部分細(xì)胞中發(fā)揮重組作用。但Cre的意外表達(dá)，或被稱為“異位”表達(dá)仍時常發(fā)生，這些異位表達(dá)可能會導(dǎo)致一些我們不希望發(fā)生的重組。因此在建立Cre小鼠時選擇譜系標(biāo)志基因很重要。高特異性的譜系標(biāo)志基因能高效精確地表達(dá)Cre，降低Cre漏表達(dá)或異位表達(dá)的概率。應(yīng)盡量避免使用那些高表達(dá)但非特異的標(biāo)志基因來構(gòu)建Cre小鼠。

在使用Reporter小鼠驗證組織特異性GeneX-Cre小鼠時，由于對GeneX本身表達(dá)譜的研究并不詳盡，GeneX可能在生殖細(xì)胞或早期胚胎發(fā)育過程中存在瞬時表達(dá)，因此常常會發(fā)現(xiàn)報告基因的表達(dá)比預(yù)期的更為廣泛。想要明確是否發(fā)生了生殖系中的Cre意外表達(dá)，可以通過將不同性別的子代小鼠(GeneXCre/wt;Reporterlox/wt)分別與野生型小鼠交配獲得第二代。如果這些二代小鼠中報告基因的表達(dá)較第一代子代更為廣泛，那么很有可能發(fā)生了Cre的生殖系表達(dá)。因為Cre介導(dǎo)的重組可能發(fā)生在配子形成的二倍體階段，發(fā)生重組后的單倍體子細(xì)胞發(fā)育成胚胎，導(dǎo)致第二代子代小鼠即使沒有Cre基因的整合，仍表達(dá)報告基因。

如果Cre小鼠發(fā)生了生殖系表達(dá)，那么在應(yīng)用該Cre小鼠進(jìn)行條件性基因打靶時，需要謹(jǐn)慎選擇Cre小鼠的性別與交配方式以及對照組。比如，母系遺傳的Cre小鼠品系，需要使用雄性帶有Cre整合的小鼠進(jìn)行繁殖；而父系遺傳的Cre品系，則需要用雌性Cre陽性小鼠來繁育。當(dāng)然，也可以通過使用誘導(dǎo)型Cre小鼠解決Cre生殖系意外表達(dá)的問題，實現(xiàn)僅在成年或胚胎發(fā)育晚期激活Cre重組活性，獲得條件性基因打靶小鼠。

要獲得條件性基因敲除小鼠至少需要兩步遺傳雜交。第一步，將GeneX-Cre雜合子小鼠與GeneY-flox雜合或純合子小鼠交配，獲得的Cre與flox雙陽性（GeneX?Cre/wt; GeneY?lox/wt）子代小鼠。第二步，將Cre與flox雙陽性（GeneX?Cre/wt;GeneY?lox/wt）子代小鼠再與GeneY-flox雜合或純合子小鼠交配，獲得所需的GeneX?Cre/wt; GeneY?lox/lox小鼠為實驗組。一般對照組為同窩GeneXwt/wt; GeneY?lox/lox小鼠。如果Cre的整合破壞內(nèi)源基因，那么應(yīng)選擇GeneX?Cre/wt;GeneY?wt/wt小鼠作為對照。

圖11. 條件性基因敲除的常規(guī)育種策略。

在進(jìn)行基因型鑒定的時候，不僅要對小鼠鼠尾進(jìn)行基因鑒定，對特異性目標(biāo)組織也需要進(jìn)行基因型檢測。這時需要設(shè)計PCR引物方便區(qū)分野生型等位基因、flox等位基因和重組后的KO等位基因。在鼠尾鑒定時，如果發(fā)現(xiàn)重組后的KO產(chǎn)物，那么需要考慮該組織特異性Cre小鼠的生殖系表達(dá)問題。

圖12. 條件性基因敲除的基因型鑒定引物設(shè)計示意圖。

之后需要檢測重組后靶基因的mRNA和蛋白表達(dá)，來驗證Cre-lox系統(tǒng)的工作效果。根據(jù)靶基因與lox位點的位置，可以設(shè)計qPCR模板或者探針來檢測重組后的靶基因轉(zhuǎn)錄情況。進(jìn)一步可以通過免疫組化檢測條件性基因敲除后靶基因蛋白翻譯是否缺失或異常。不過這很大程度上依賴于探針或抗體的靈敏度和特異性。

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