今天小編將給大家梳理一下以基因修飾小鼠為核心的疾病研究課題應(yīng)該如何設(shè)計(jì)，需要遵循哪些基本原則，注意哪些問(wèn)題。

疾病是多種多樣的，但是研究疾病的方法是萬(wàn)變不離其宗。希望讀完本文，對(duì)大家不論是閱讀文獻(xiàn)，設(shè)計(jì)規(guī)劃課題，申請(qǐng)基金或者是發(fā)表高水平的研究論文，能有一些相應(yīng)的啟發(fā)或者是幫助。

想要運(yùn)用基因修飾動(dòng)物模型進(jìn)行疾病的體內(nèi)研究，需要有一個(gè)研究的目的基因(A)，一個(gè)要研究的疾病領(lǐng)域(B)，要有相應(yīng)的模型(C)，并且這個(gè)基因在這個(gè)疾病模型中要有表型(D)。體內(nèi)研究的本質(zhì)其實(shí)是利用目的基因(A)的修飾在動(dòng)物模型(C)上呈現(xiàn)出類似人類疾病(B)的表型改變(D)。其中基因是原因，疾病是一種宏觀結(jié)果，表型是具象結(jié)果；而模型是重現(xiàn)整個(gè)過(guò)程的工具，也是整個(gè)研究的基石（Fig.1）?；蚝湍Ｐ偷倪x擇將直接關(guān)系到整個(gè)課題的質(zhì)量與結(jié)果。

Fig.1 體內(nèi)研究的組成要素

基因不是脫離背景隨機(jī)選擇的，它一定要照顧到跟其他幾個(gè)要素的關(guān)系，首先要考慮它與研究疾病的關(guān)系，這里要體現(xiàn)出創(chuàng)新性與相關(guān)性。

這里的創(chuàng)新性不代表我們一定要選擇全新發(fā)現(xiàn)的基因或者是研究背景非常稀少的基因，可以選擇一個(gè)經(jīng)典的基因，但他在我們研究的疾病領(lǐng)域沒(méi)有過(guò)相關(guān)報(bào)道；或者經(jīng)典的基因，相同的疾病領(lǐng)域，但是運(yùn)用創(chuàng)新型的模型；再或者經(jīng)典的基因，相同的疾病領(lǐng)域，但找到了新的突變。或者是我們研究一些真正創(chuàng)新性的基因，比如一些非編碼的基因，microRNA，lncRNA或circRNA。

Fig2經(jīng)典基因，同類疾病，不同基因修飾模型研究論文示例

這里是一個(gè)例子，研究同一個(gè)熱門靶點(diǎn)基因Trem2在同一種疾病-阿茲海默癥的作用，實(shí)際可以發(fā)表不同的研究論文（Fig.2）。第一篇文獻(xiàn)運(yùn)用了Trem2人源化基因修飾模型，第二篇?jiǎng)t是使用Trem2的敲除模型。這提示我們研究經(jīng)典基因在疾病中的功能時(shí)可以尋求不同的基因修飾模型，再加上找好研究角度及檢測(cè)指標(biāo)，實(shí)際上也可以體現(xiàn)創(chuàng)新性。

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在討論基因與疾病臨床相關(guān)性時(shí)，其實(shí)講的是基因在臨床樣本中是否有差異，包括表達(dá)的差異性，基因的突變或者修飾等等。而差異性又是否與疾病的嚴(yán)重程度，生存率等等掛鉤。如果有，則必須在課題設(shè)計(jì)或者文章當(dāng)中有所體現(xiàn)。那我們?cè)趺慈カ@取這些臨床相關(guān)性的基因呢，一方面就是自己使用臨床樣本進(jìn)行高通量篩查；或者是查閱一些臨床實(shí)驗(yàn)文獻(xiàn)；再或者找到我們所研究疾病的一些基因表達(dá)數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行查閱。

基因的功能往往通過(guò)基因與表型的關(guān)系體現(xiàn)出來(lái)，牽扯到基因修飾的方向以及所帶來(lái)的表型后果?；蛐揎椀姆较蛑粺o(wú)非是過(guò)表達(dá)一個(gè)基因，然后觀察這個(gè)基因所帶來(lái)功能的獲得，這其實(shí)體現(xiàn)的是充分條件關(guān)系，所講述的邏輯是，一旦有這個(gè)基因，就能獲得這個(gè)功能。之二無(wú)非是敲除或敲低一個(gè)基因，觀察這個(gè)基因缺失帶來(lái)的功能缺失，體現(xiàn)的是必要條件關(guān)系，所講述的邏輯是，一旦沒(méi)有這個(gè)基因，就無(wú)法實(shí)現(xiàn)某種功能。目前來(lái)看，基因敲除或條件性敲除是更容易出表型的一種修飾方式，也是目前來(lái)講發(fā)表文章最多的。但是近些年來(lái)，過(guò)表達(dá)因?yàn)楝F(xiàn)成模型較少，有創(chuàng)新性，而且可以去過(guò)表達(dá)一些其他物種包括人源的基因，所以應(yīng)用場(chǎng)景也慢慢多了起來(lái)。

Fig.3 基因(A)與表型(D)的關(guān)系要體現(xiàn)基因(A)的功能性

那我們?cè)趺慈フ业疥P(guān)于目標(biāo)基因跟表型關(guān)系的線索，有個(gè)較為全面的MGI數(shù)據(jù)庫(kù)（http://www.informatics.jax.org/），這個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)記錄所有基因曾經(jīng)有過(guò)的記錄在冊(cè)的相關(guān)基因修飾模型，以及曾經(jīng)發(fā)表過(guò)的文章，如果我們現(xiàn)在手頭就有個(gè)比較感興趣的基因，可以從這個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)中找到某些表型線索，如果恰好有比較契合自己研究疾病的表型出現(xiàn)，就可以運(yùn)用到自己的研究當(dāng)中去。由于篇幅所限，這個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)如何使用，我們?cè)诤笃趩为?dú)推送相關(guān)文章，請(qǐng)感興趣的讀者持續(xù)關(guān)注。

除了基因以外，模型的選擇也非常關(guān)鍵。根據(jù)模型與其他兩個(gè)要素的關(guān)系，可以分為基因模型和疾病模型（Fig.4）。兩者可以合二為一，但需要做到這個(gè)基因的功能足夠關(guān)鍵，修飾它可以直接誘發(fā)疾病，還要做到這個(gè)基因具有一定的創(chuàng)新性，在該領(lǐng)域中沒(méi)怎么報(bào)道過(guò)。大部分情況下，我們的所研究的基因只是疾病發(fā)生的一個(gè)必要非充分條件，因此需要分開(kāi)構(gòu)建。

Fig.4 疾病研究中模型的分類

比如，發(fā)表在Cell雜志上的“TREM2 Maintains Microglial Metabolic Fitness in Alzheimer’s Disease”這篇論文研究在分組時(shí)就很清晰地描述了幾個(gè)模型：WT、5xFAD、Trem2^-/-、和Trem2^-/-&5xFAD，其中WT是野生型的“對(duì)照模型”；5xFAD轉(zhuǎn)基因小鼠過(guò)度表達(dá)帶有人類Swedish和Indiana突變的淀粉樣蛋白前體相關(guān)基因，使其出現(xiàn)類似于人類阿茲海默癥的癥狀，這就屬于所謂“疾病模型”；而Trem2是本篇文章研究的靶標(biāo)基因，Trem^-/-小鼠則屬于所謂的“基因模型”；Trem-/-; 5xFAD小鼠則是“基因模型”與“疾病模型”疊加的產(chǎn)物，也是可以確定目的基因Trem在阿茲海默癥中功能的最終模型。

Fig.5 基因模型和疾病模型在具體文獻(xiàn)(Cell，2015)中的示例

我們?cè)谶x擇疾病模型的時(shí)候要注意類似性，重復(fù)性，可靠性等原則。簡(jiǎn)單來(lái)講，類似性就是選用的模型要跟人體發(fā)病過(guò)程類似；重復(fù)性就是多次實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致，同批實(shí)驗(yàn)，動(dòng)物表型均一。而可靠性主要是需要排除該疾病模型中，一些其他疾病的干擾，證明目標(biāo)表型的出現(xiàn)是可靠的。

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我們就以腫瘤模型為例（Table 1），移植瘤模型中，人源腫瘤相比于鼠源腫瘤更接近人體腫瘤的真實(shí)情況，因此在類似性上更有優(yōu)勢(shì)。原發(fā)腫瘤模型中的誘導(dǎo)型模型一般是使用較強(qiáng)劑量的致癌物質(zhì)，不太符合患者正?；及┑恼鎸?shí)情況，類似性不好。因?yàn)檫^(guò)度刺激，還會(huì)誘發(fā)一些其他疾病，可靠性也較差?；蛐揎椖[瘤小鼠，可以保留一些腫瘤微環(huán)境，類型性可靠性可以得到保證，但同一批次發(fā)生腫瘤的時(shí)間會(huì)有差異，就需要擴(kuò)大篩選。由于模型的不完美性，多疾病模型論證就比較流行，在腫瘤研究中以基因修飾小鼠腫瘤模型為主，人源移植瘤為輔的方式較為多見(jiàn)。

Table 1?各類腫瘤模型的特性

對(duì)于基因模型的選擇，主要注意的是我們選擇什么樣的基因修飾類型，一般分為轉(zhuǎn)基因，敲除，點(diǎn)突變和基因敲入。在這里需要強(qiáng)調(diào)的一點(diǎn)是在基因修飾類型上有條件的話，也盡量采用多模型論證法，可以加大實(shí)驗(yàn)說(shuō)服力。

Fig.6 基因模型的多模型論證示例（Circulation, 2018）

這里是多模型論證的一個(gè)示例（Fig.6），發(fā)表在Circulation上的“Vascular Smooth Muscle-Specific Progerin Expression Accelerates Atherosclerosis and Death in a Mouse Model of Hutchinson-Gilford Progeria Syndrome”這篇論文中研究人員比較巧妙地構(gòu)建了一個(gè)品系，同時(shí)實(shí)現(xiàn)核纖層蛋白Lamin A的敲除和點(diǎn)突變（臨床上已發(fā)現(xiàn)其突變體與臨床相關(guān)）。研究人員通過(guò)打靶就把一組loxP-stop-loxP序列和突變的位點(diǎn)引入小鼠相應(yīng)的基因組位置，由于stop序列的存在，A蛋白無(wú)法翻譯出來(lái)，是敲除的模型。而一旦與Cre工具鼠交配，stop序列將被刪掉，A蛋白將會(huì)以突變形式（Progerin）被翻譯出來(lái)，這樣就可以一舉兩得。

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談及這個(gè)例子的目的并不是鼓勵(lì)大家一定要一次性構(gòu)建出這類“兩用”模型（是否可行取決于基因結(jié)構(gòu)及其他特性），而主要是說(shuō)明往往我們?cè)谶M(jìn)行科學(xué)論證的時(shí)候，對(duì)同一問(wèn)題，需要從不同的角度或不同模型去論證，這種思想需要貫穿著整個(gè)科研歷程。

我們所有的研究成果，都需要使用表型數(shù)據(jù)給呈現(xiàn)出來(lái)。表型也可分為疾病模型表型和基因模型表型。表型呈現(xiàn)的基本邏輯有兩種，一種是回復(fù)驗(yàn)證，具體是構(gòu)建了疾病模型，表型出現(xiàn)了，若疊加基因模型將會(huì)回復(fù)該表型，使病情得到緩解。另一種，遞進(jìn)驗(yàn)證，具體是構(gòu)建疾病模型，表型出現(xiàn)了，若疊加基因模型將會(huì)加劇該表型。

表型回復(fù)驗(yàn)證的示例（Fig.7），來(lái)自O(shè)ncogene的“MembraneMucin Muc4 promotes blood cell association with tumor cells and mediatesefficient metastasis in a mouse model of breast cancer”這篇文章中介紹乳腺癌模型的肺轉(zhuǎn)移表型檢測(cè)，NDL代表的是乳腺癌的疾病模型，在小鼠肺部出現(xiàn)了多處病灶，而疊加了基因敲除模型Muc4KO，發(fā)現(xiàn)純合子Muc4KO/NDL中，病灶大大減少。這就是典型的回復(fù)驗(yàn)證。

Fig.7 敲除目的基因Muc4后乳腺癌肺轉(zhuǎn)移情況減輕示例（Oncogene，2018）

表型遞進(jìn)驗(yàn)證的示例（Fig.8），還是上文提到的Circulation雜志關(guān)于“動(dòng)脈粥樣硬化”的文章， ApoE基因敲除小鼠喂高脂高膽固醇飼料，可以誘發(fā)動(dòng)脈粥樣硬化，這類疾病小鼠模型將其主動(dòng)脈通過(guò)油紅染色，看到實(shí)際上在血管壁上是有脂肪堆積的。而疊加了基因模型之后，脂肪堆積的程度明顯更高了，而且小鼠的生存率大大降低。這就是采用了遞進(jìn)驗(yàn)證的方法去驗(yàn)證基因功能。

Fig.8 Lmna點(diǎn)突變小鼠動(dòng)脈粥樣硬化表型加重示例（Circulation，2018）

回復(fù)驗(yàn)證和遞進(jìn)驗(yàn)證該如何選擇，這往往要考量疾病模型和基因特性兩個(gè)方面，如果疾病模型的疾病表現(xiàn)非常嚴(yán)重，這時(shí)候往往采用回復(fù)驗(yàn)證的方法，因?yàn)楹茈y在一個(gè)高表現(xiàn)的表型上去體現(xiàn)疾病加重。反之，就采用遞進(jìn)驗(yàn)證。對(duì)于基因來(lái)說(shuō)，如果這個(gè)基因是疾病發(fā)生的必要條件因子，那就采用回復(fù)驗(yàn)證的方式，反之如果是充分條件因子，則可以采用遞進(jìn)驗(yàn)證。

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對(duì)表型的檢測(cè)途徑（Fig.9）是需要通過(guò)不同的檢測(cè)方法和不同的分子標(biāo)記來(lái)實(shí)現(xiàn)，需要時(shí)刻遵守多角度論證的思維，即一種疾病盡量采用多個(gè)表型去驗(yàn)證，而一種表型多個(gè)檢測(cè)方法驗(yàn)證，同一種檢測(cè)方法也需要盡量采用多個(gè)標(biāo)志物（Marker）來(lái)驗(yàn)證。

Fig.9 表型檢測(cè)途徑

上文提到Oncogene關(guān)于乳腺癌的研究文章，里面分別檢測(cè)了原發(fā)瘤和轉(zhuǎn)移瘤（Fig.10）兩個(gè)表型，發(fā)現(xiàn)敲除目的基因Muc4對(duì)于原發(fā)瘤的影響很小，原發(fā)灶依然是高分化異質(zhì)性的乳腺癌；然而轉(zhuǎn)移灶明顯減少。這就表明，盡量多檢測(cè)幾個(gè)表型，可以避免忽略所研究目的基因應(yīng)有的功能。

Fig.10 原發(fā)瘤和轉(zhuǎn)移灶的表型研究示例（Oncogene，2018）

一種表型采用多個(gè)檢測(cè)手段的示例（Fig.11)，使用Westernblot以及免疫熒光兩種方法去檢測(cè)同一種蛋白的表達(dá)情況，可以避免由于某種技術(shù)手段本身的限制帶來(lái)的對(duì)表型的誤判。

Fig.11 對(duì)同一表型采用不同檢測(cè)方法的示例（Leukemia，2020）

一種檢測(cè)方法采用多個(gè)標(biāo)志物檢測(cè)的示例（Fig.12），同時(shí)采用F4/80和CD41標(biāo)識(shí)巨噬細(xì)胞和血小板，表明Muc4敲除后，巨噬細(xì)胞和血小板等免疫細(xì)胞的數(shù)目變化跟腫瘤組織大小具有相關(guān)性。通過(guò)標(biāo)志物的多樣性，去檢測(cè)同一個(gè)表型的多個(gè)維度，可以增加實(shí)驗(yàn)的可信度。

Fig.12同一檢測(cè)方法利用不同標(biāo)志物進(jìn)行檢測(cè)的示例（Oncogene，2018）

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文中示例文獻(xiàn)：