2月26日，國際學術期刊?Science?以 Research Article形式在線發(fā)表了中國科學院分子細胞科學卓越創(chuàng)新中心（生物化學與細胞生物學研究所）周斌研究組的研究成果“Proliferation tracing reveals regional hepatocyte generation in liver homeostasis and repair”。

南模生物為該研究構建了關鍵的Ki67-CreXER2小鼠模型。

該研究首次開發(fā)了能夠長時程示蹤體內細胞增殖的新技術，利用該技術研究人員發(fā)現了成體肝細胞的來源，為肝臟再生及疾病臨床治療研究提供了新思路。

Fig.1 Generation and characterization of Ki67-CrexER mice. A. Schematic showing ProTracer strategy. B.?Schematic showing a Ki67?fate map.

周斌研究組利用ProTracer研究了在成體肝臟生理穩(wěn)態(tài)和損傷再生過程中肝細胞的來源。

目前，在肝臟領域，這是一個亟待解決且具有爭議的重要科學問題。盡管在某些極其嚴重的肝損傷情況下，膽管細胞可以轉分化貢獻形成肝細胞，但是在肝臟生理穩(wěn)態(tài)和損傷再生過程中的肝細胞的更新主要依賴原有肝細胞的自我增殖。肝臟的基本結構單位是肝小葉，肝小葉中的肝細胞由于代謝功能和基因表達等的不同具有較大的異質性，從肝門靜脈區(qū)到肝中央靜脈區(qū)大體可分為三區(qū)：門靜脈周圍肝細胞（E-CAD+，Zone 1）、中間區(qū)肝細胞（E-CAD–GS–，Zone 2）和中央靜脈周圍肝細胞（GS+，Zone 3）。

有研究認為不同區(qū)域的肝細胞增殖能力顯著不同, 但究竟哪些肝細胞亞群對新生肝細胞起主要貢獻仍存在較大爭議，目前主要有以下幾種理論：

Fig.2 Schematic showing three liver zones from the periportal to the pericentral region. Lower panel shows immunostaining for glutamine synthetase (GS) and E-cadherin (E-CAD). 1, 2, and 3 indicate zone 1 (E-CAD+), zone 2 (E-CAD-GS-), and zone 3 (GS+), respectively. Dashed arrow indicates blood flow.

周斌研究組突破以往的研究模式，即不再依賴單一分子標記追蹤某一肝細胞亞群的擴增情況，而是利用ProTracer技術去直接標記新生的肝細胞，不僅可以實現對所有肝細胞類群進行分析，還可以直觀精準地展現出新生肝細胞的來源。研究人員首先采用廣譜性的ProTracer（所有類型細胞的增殖都能夠被檢測）在成體啟動細胞增殖的記錄，并在啟動后的多個不同時間點檢測肝細胞的增殖信號，結合E-CAD和GS等肝細胞分區(qū)標記基因免疫熒光共染色，發(fā)現在生理穩(wěn)態(tài)過程中肝細胞通過緩慢的增殖維持自我更新。意外的是，新生的肝細胞并非來源于以往報道的任何一個類群，而是主要來源于肝小葉中的中間區(qū)域（E-CAD–GS–，Zone 2）。

Fig.3?ProTracer reveals highly regional hepatocyte proliferation in the liver lobule. A.?Schematic showing the experimental strategy using ProTracer (R26-DreER;Ki67-CrexER;R26-GFP). B.?Immunostaining for GFP, GS, and E-CAD on liver sections at baseline (day 0) and day 2 after Tam treatment. Arrowhead indicates GFP+ hepatocyte. C.?Immunostaining for GFP, GS, E-AD, and b-catenin on liver sections collected at weeks 2, 4, 6, 8, 10, and 12 after Tam treatment. D.?Quantification of the percentage hepatocytes (Hep) expressing GFP in each zone of the liver lobule.

將肝細胞特異性ProTracer在成體啟動后，研究人員將肝臟的全標本進行了熒光拍照，發(fā)現被tdTomato紅色熒光標記的增殖的肝細胞呈現出一圈圈類似“甜甜圈”的形狀（圖A），說明肝細胞增殖具有區(qū)域偏好性，肝臟組織切片的免疫熒光染色結果進一步證實了增殖的肝細胞位于肝小葉的中間區(qū)域，即E-CAD–GS–的Zone 2（圖B）。此外，周斌組還開發(fā)了活體檢測肝細胞增殖的ProTracer技術，利用該技術他們檢測了同一個小鼠個體在多個不同時間點肝細胞的增殖及其動態(tài)變化過程，這也是世界上首次實現活體檢測細胞增殖。

Fig.5 A.利用肝細胞特異性的ProTracer標記增殖肝細胞的成體小鼠肝臟。tdTomato+的增殖肝細胞呈現出一圈圈的類似“甜甜圈”的形狀。B.利用ProTracer揭示成體肝臟中新生肝細胞（tdTomato+）主要來源于E-CAD–GS– Zone 2。E-CAD（綠色）；GS（青色）。

為了研究肝臟損傷再生過程中新生肝細胞的來源，研究人員利用ProTracer技術結合肝切、膽管結扎和CCl4等多種肝損傷模型，發(fā)現在肝切模型中，位于Zone 1的肝細胞起始肝臟再生過程，然后Zone 2 的肝細胞迅速增殖。而在膽管結扎和CCl4急性損傷模型中，則是位于Zone 2的肝細胞起始肝臟再生過程。此外，研究人員利用廣譜性ProTracer系統(tǒng)地描繪了肝臟再生過程中其他類型細胞的增殖情況，如膽管上皮細胞、內皮細胞、成纖維細胞、巨噬細胞。

綜上，該研究的亮點在于開發(fā)了一種檢測細胞增殖的遺傳新技術——ProTracer，以全新的視角研究了成體肝細胞的來源，突破了傳統(tǒng)思維模式和技術局限性，直觀地展現了所有肝細胞類群的增殖情況，首次發(fā)現肝小葉中間區(qū)域（Zone 2）的肝細胞是成體肝臟在生理穩(wěn)態(tài)中新生肝細胞的主要細胞來源，同時揭示了不同損傷再生模型中新生肝細胞的來源，準確回答了成體肝細胞來源這一重要科學問題。該研究為肝臟損傷修復再生研究開辟了新思路，為肝臟疾病的治療提供了新的理論基礎。

此外，新開發(fā)的ProTracer技術具有長時間不間斷檢測細胞增殖的能力，可以特異性地標記某種特定細胞譜系的細胞增殖，并且實現了不犧牲樣品直接活體檢測細胞增殖，從多個維度刷新了細胞增殖檢測的能力和范圍，可以廣泛應用于不同組織器官細胞增殖的檢測，為發(fā)育生物學、腫瘤學、神經科學和再生醫(yī)學等眾多領域的研究提供強大技術支撐。