今年四月份，Sangamo和輝瑞公布了血友病A基因治療1/2期臨床中期數(shù)據(jù)，使血友病的基因療法又向前推動(dòng)了一步；早在2017年年底，輝瑞與Spark Therapeutics就公布了血友病B基因療法SPK-9001的1/2期臨床中期數(shù)據(jù)。此外，罕見病專業(yè)公司BioMarin也宣布今年下半年將會(huì)提交其血友病A基因療法（valrox）的上市申請。

血友病為一組遺傳性凝血功能障礙的出血性疾病，其共同的特征是活性凝血活酶生成障礙，凝血時(shí)間延長，終身具有輕微創(chuàng)傷后出血傾向，重癥患者沒有明顯外傷也可發(fā)生“自發(fā)性”出血。根據(jù)凝血因子差異可分為由FVIII凝血因子功能異常導(dǎo)致的血友病A(hemophilia A，HA)與FIX凝血因子異常所致的血友病B(hemophilia B，HB)。流行病學(xué)調(diào)查結(jié)果顯示，血友病A在男性人群中的發(fā)病率約為1/5000[1]，血友病B的發(fā)病率約為1/25000[2];血友病A占總發(fā)病率的80%到85%。血友病作為一種血液性罕見病，患者極易出現(xiàn)軀體畸形，嚴(yán)重時(shí)甚至危及生命，然而尚無治愈的方法。作為一種單基因遺傳性疾病，目前正在研究的基因治療則具有治愈血友病的可能。在基因治療的研究中,動(dòng)物模型的應(yīng)用是必不可少的基礎(chǔ)支持條件。

因此，建立與人類血友病生物學(xué)特性和臨床表征相近的動(dòng)物模型，對于血友病發(fā)病機(jī)制的研究以及新型藥物的開發(fā)具有重要的意義。繼前幾期的腫瘤模型后，今天小編就給大家簡單介紹一下小鼠血友病模型的發(fā)展歷程及現(xiàn)狀。

血友病哺乳動(dòng)物模型的初現(xiàn)

第一例血友病模型形成于上世紀(jì)七八十年代，科學(xué)家發(fā)現(xiàn)狗因體內(nèi)編碼FIX因子的基因突變導(dǎo)致該凝血因子活性喪失，其發(fā)病機(jī)制及臨床病理表現(xiàn)與人類HB極為類似。20世紀(jì)末，Monahan指出這種天然的血友病犬模型可以用于基因治療的臨床前動(dòng)物試驗(yàn)[3]。同時(shí)，國內(nèi)外科學(xué)家利用ES細(xì)胞打靶的方式獲得了血友病HA小鼠模型和血友病HB小鼠模型。

血友病大、小鼠模型的發(fā)展

隨著基因編輯技術(shù)的不斷發(fā)展，Nielsen在2014年運(yùn)用ZFN鋅指核酸酶技術(shù)構(gòu)建了血友病大鼠模型，相比于血友病小鼠模型，其采血量及自發(fā)性出血等方面的問題得以改善^[4]。隨后，科學(xué)家相繼運(yùn)用該大鼠模型進(jìn)行了血友病疾病等方面的深入研究。CRISPR-Cas9技術(shù)的應(yīng)用極大的推動(dòng)了基因功能的研究?？蒲泄ぷ髡邞?yīng)用CRISPR-Cas9技術(shù)通過對小鼠F9因子第8外顯子核心功能區(qū)進(jìn)行定點(diǎn)編輯獲得了小鼠血友病HB模型^[5]。

2016年，模擬病人突變的點(diǎn)突變小鼠F9Y381D構(gòu)建成功，同時(shí)還成功制備了F9Y381S突變小鼠及第383 位氨基酸突變?yōu)榻K止密碼子的敲除小鼠F9383STOP^[6]。同年，F(xiàn)8因子敲除即HA小鼠模型也被成功構(gòu)建^[7]。血液病小鼠模型的成功構(gòu)建極大的推動(dòng)了血友病的研究。

Tab.1?血友病動(dòng)物模型匯總^[8]

根據(jù)客戶需求，南模生物自主研發(fā)了F8與F9基因敲除小鼠模型！

FVIII基因敲除小鼠模型

人的FVIII基因位于X染色體上，全長186kb，由26個(gè)外顯子組成。臨床研究表明，血友病A主要是由于FVIII基因的點(diǎn)突變、基因倒置、小段基因的缺失和插入造成的。南模生物自主研發(fā)的FVIII基因敲除小鼠是在小鼠胚胎干細(xì)胞（SCR012，來源于129S6/SVEV）上以同源重組方式造成內(nèi)源FVIII基因序列部分缺失（16~19外顯子），進(jìn)而通過四倍體補(bǔ)償技術(shù)獲得完全胚胎干細(xì)胞來源的FVIII基因敲除小鼠，該小鼠進(jìn)一步與C57BL/6J小鼠交配育種。

Fig.2 FVIII基因敲除小鼠構(gòu)建策略示意圖；利用ES打靶的技術(shù)，用Neo基因替換FVIII基因的16-19外顯子。

Fig.3?FVIII基因敲除小鼠基因型鑒定

Fig.4 A. FVIII基因敲除小鼠FVIII活性檢測；雄性雜合子（-/y）和雌性純合子（-/-）小鼠的FVIII活性僅為野生型（wt）小鼠的8%和10%，而雌性雜合子小鼠的活性為野生型小鼠的80%。B. FVIII基因敲除小鼠APTT（凝血活酶時(shí)間）檢測；雌性雜合子小鼠的APTT時(shí)間比野生型小鼠的略有延長，而雄性雜合子（-/y）和雌性純合子（-/-）小鼠的APTT值均大于120秒。

FVIII基因敲除小鼠是在整體動(dòng)物水平研究血友病A發(fā)病機(jī)制和藥物篩選的理想動(dòng)物模型，該小鼠模型具有明確的血友病A癥狀。飼養(yǎng)時(shí)需注意同籠小鼠間爭斗可能導(dǎo)致小鼠內(nèi)出血甚至死亡，剪尾后必須采取及時(shí)的止血措施，防止敲除純合子小鼠失血和死亡。

FIX基因敲除小鼠模型

人的FIX基因位于X染色體上，全長31kb，由8個(gè)外顯子組成。南模生物通過CRISPR/Cas9技術(shù)編輯FIX基因，造成蛋白翻譯移碼突變并提前終止。

Fig.5 F9因子敲除小鼠構(gòu)建策略圖；利用CRISPR基因編輯技術(shù)，針對小鼠F9基因exon8設(shè)計(jì)gRNAs，獲得F9基因敲除小鼠模型。

Fig.6 A. 肝組織中F9基因的表達(dá)；純合突變小鼠的肝臟中F9因子的表達(dá)顯著性降低。B.血漿中FIX蛋白的濃度，純合突變小鼠的血漿中F9因子的濃度顯著性降低。

FIX基因敲除小鼠是血友病B治療藥物的篩選和評價(jià)及血友病B基因治療的理想動(dòng)物模型。F9基因敲除純合子小鼠可正常發(fā)育、存活、繁育。飼養(yǎng)時(shí)同樣需要注意敲除純合子本身出血的傾向性，放于單籠精心喂養(yǎng)。

如果您有血友病小鼠模型方面的需求，歡迎隨時(shí)咨詢?。?！

參考文獻(xiàn)：

1.?Callan MB，Haskins ME,?Wang P,?et al.?Successful phenotype?improvement following gene therapy for severe hemophilia A in privately owned dogs [J].?PLoS One,?2016,?11(3): e0151800.?

2.?World?Federation of Hemophilia.?Report on the annual global?survey 2012 [M].?Montreal: WFH,?2013, 10.

3.?Monahan PE,?Samulski?RJ,?Tazelaar J,?et al.?Direct?intramuscular injection with rAAV vectors results in sustained expression in a dog model of hemophilia [J].?Gene Ther,?1998,?5(1): 40-49.

4.?Nielsen LN, Wiinberg B, H?ger M, et?al. A novel F8 -/-?rat as a translational model of human hemophilia A?[J]. J Thromb Haemost,?2014, 12(8):1274-82.

5.?汪啟翰，懷聰，孫瑞林等.?利用CRISPR/Cas系統(tǒng)快速高效構(gòu)建血友病乙小鼠模型[J]. 遺傳，2015，37（11）：143-148.

6.?關(guān)玉婷.?CRISPR-Cas9技術(shù)在B型血友病小鼠模型構(gòu)建及治療的應(yīng)用研究[D].?上海：華東師范大學(xué)，2016.

7.?常士偉.?利用TALEN和CRISPR/Cas9技術(shù)構(gòu)建甲型血友病小鼠模型[D].?南京：南京師范大學(xué)，2016.

8.?Denise ES, Timothy CN, Elizabeth M, et?al. Animal Models of Hemophilia?[J].?

Prog Mol Biol Transl Sci,?2012; 105: 151–209.