根據(jù)《臨床醫(yī)師癌癥雜志》在線發(fā)表的“2018年全球癌癥統(tǒng)計數(shù)據(jù)”，去年全球有約180萬結(jié)直腸癌新發(fā)病例，發(fā)病率（10.2%）及死亡率（9.2%）都在排行榜前三（Table1）^[1]，是最常確診且危害最嚴(yán)重的癌癥之一，由于人口增長、衰老以及人類生活方式的改變，結(jié)直腸癌的發(fā)病負(fù)擔(dān)還在逐年加重，而搞清其發(fā)病機制，對找到正確的預(yù)防治療方式、改善患者不良預(yù)后和降低死亡率至關(guān)重要。

結(jié)直腸癌小鼠模型能夠模擬人體結(jié)直腸癌的發(fā)生發(fā)展，在疾病發(fā)生機理研究，藥物新靶點發(fā)現(xiàn)及臨床前藥效學(xué)評價等方面具有十分重要的理論價值和臨床意義。本期將帶大家了解一下這些常用的結(jié)直腸癌模型。

Table1 2018年全球主要癌癥發(fā)病率及死亡率統(tǒng)計

結(jié)直腸癌模型主要分為移植瘤模型和原發(fā)瘤模型兩種。

結(jié)直腸癌移植瘤模型

結(jié)直腸癌移植瘤模型就是將人體或小鼠原發(fā)的結(jié)直腸癌組織或細(xì)胞移植到小鼠身上使其生長成腫瘤的動物模型。該模型的優(yōu)點是周期短、成本低，目前在實驗室中應(yīng)用較為廣泛。根據(jù)移植物來源可分為同種移植和異種移植。

同種移植采用鼠源組織或細(xì)胞，其中MC38小鼠結(jié)腸癌細(xì)胞的移植最為常見，多用作結(jié)直腸癌發(fā)生及轉(zhuǎn)移方向研究，并成為腫瘤藥效驗證的常用途徑。

異種移植采用人源組織或細(xì)胞，更接近人體腫瘤真實情況，也因此更受歡迎，但其需要免疫缺陷小鼠作為宿主，想了解什么樣的免疫缺陷小鼠可滿足實驗要求，可點擊“你選對免疫缺陷小鼠了嗎？”進(jìn)行查看。

目前人源性結(jié)直腸癌移植瘤（異種移植）模型主要分為兩種，一種是將人源的結(jié)直腸癌細(xì)胞系接種到免疫缺陷小鼠體內(nèi)，稱為CDX模型（cell-line-derived xenograft），另一種是將來源于患者的結(jié)直腸癌組織塊接種到免疫缺陷小鼠體內(nèi)，稱為PDX模型（patient-derived xenograft）。

由于用作CDX模型的人源結(jié)直腸癌細(xì)胞系具有易獲取，成瘤效果好，驗證數(shù)據(jù)詳實（有大量細(xì)胞功能學(xué)和藥效數(shù)據(jù)可供參考）以及操作成本低等優(yōu)勢，在各類實驗室中都有使用。

在結(jié)直腸癌研究當(dāng)中，KRAS基因突變已被鑒定為預(yù)測西妥昔（Cetuximab）療效的生物學(xué)標(biāo)志物；在很多病例當(dāng)中，BRAF、TP53等基因突變被發(fā)現(xiàn)于結(jié)直腸癌不同的發(fā)展階段；而MSI（microsatellite instability）是判斷結(jié)直腸癌類型的一種重要指標(biāo)。那么針對于這些不同的結(jié)直腸癌研究方向，應(yīng)該選擇分子特征與之匹配的細(xì)胞系（Table2）進(jìn)行CDX模型的構(gòu)建。

Table2 部分結(jié)腸癌細(xì)胞系分子特征一覽表*

*各細(xì)胞系在免疫缺陷鼠中的成瘤性最好通過預(yù)實驗確定。

另外，若是僅進(jìn)行腫瘤增殖角度的研究，使用皮下成瘤模型即可，屬于最常用的體內(nèi)模型。而若要進(jìn)行轉(zhuǎn)移角度的研究，則需要構(gòu)建尾靜脈注射轉(zhuǎn)移模型或脾臟接種轉(zhuǎn)移模型。前者多造成結(jié)直腸癌的肺轉(zhuǎn)移，常用于研究肺轉(zhuǎn)移機理或篩選抑制肺轉(zhuǎn)移的藥物；后者多造成結(jié)直腸癌的肝臟轉(zhuǎn)移，模型的表型更接近于結(jié)直腸癌術(shù)后肝轉(zhuǎn)移的臨床特征，其具有造模簡單，轉(zhuǎn)移率高等特點^[2]。

人源細(xì)胞系在傳代的過程中，其腫瘤細(xì)胞學(xué)特征、表達(dá)譜水平及腫瘤異質(zhì)性與原始腫瘤差別較大，在藥效預(yù)測方面很可能無法滿足需求。PDX模型應(yīng)運而生，其將手術(shù)中獲得的新鮮腫瘤組織移植到免疫缺陷小鼠，以精確模擬患者腫瘤的生物學(xué)特性及不同患者間腫瘤的異質(zhì)性。結(jié)直腸癌PDX模型在組織病理學(xué)、癌基因表達(dá)及對藥物反應(yīng)上均可較好的復(fù)制原發(fā)腫瘤的生物學(xué)特點，具有較好的臨床預(yù)見性。

通過移植人源CD34⁺造血干細(xì)胞或者PBMC到免疫缺陷小鼠體內(nèi)（即建立人源化免疫重建小鼠），在此基礎(chǔ)上構(gòu)建PDX，則成為Hu-PDX模型。此類模型不僅能夠提供與人體腫瘤生長類似的免疫微環(huán)境，同時還能解決常規(guī)結(jié)直腸癌PDX模型因使用免疫缺陷小鼠而無法用于抗腫瘤免疫藥物評估的問題。

結(jié)直腸癌原發(fā)瘤模型

在藥物篩選、藥效評價或臨床預(yù)測方面，移植瘤顯然有獨特的優(yōu)勢。但若我們想探究結(jié)直腸癌發(fā)生或轉(zhuǎn)移的內(nèi)在機理，顯然原發(fā)瘤模型更為適合。目前主流的結(jié)直腸癌原發(fā)瘤模型分為誘發(fā)型結(jié)直腸癌模型和基因工程小鼠結(jié)直腸癌模型。

誘發(fā)型結(jié)直腸癌模型

誘發(fā)型結(jié)直腸癌模型多采用化學(xué)誘發(fā)途徑（Fig1），常用的誘導(dǎo)劑有二甲基肼(dimethylhydrazine,DMH)、氧化偶氮甲烷(azoxymethane,AOM)及致炎劑葡聚糖硫酸鈉(dextran sulfate sodiuln, DSS)。DMH本身不致癌，但在肝細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)被氧化成甲基氧化偶氮甲醇，隨膽汁進(jìn)入腸腔，則會引起結(jié)直腸癌上皮癌變。AOM是DMH在肝臟的代謝產(chǎn)物，它通過DNA烷化，促進(jìn)堿基的錯誤配對而致癌。DMH和AOM都可以誘發(fā)降結(jié)腸腫瘤，但后者相比前者的致癌性更加穩(wěn)定高效。DSS是人工合成的一種硫酸多糖，其單獨使用會造成小鼠結(jié)腸炎癥，以Th1/Th2細(xì)胞功能失調(diào)為特征，并伴有一定幾率的腸癌發(fā)生。而AOM和DSS聯(lián)合使用則可以穩(wěn)定地誘發(fā)炎癥性結(jié)直腸癌。

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Fig1 結(jié)直腸癌模型不同化學(xué)誘發(fā)途徑^[3]

基因工程小鼠結(jié)直腸癌模型

近些年由于基因編輯門檻的下降，基因工程小鼠結(jié)直腸癌模型流行起來。該類模型是直接將結(jié)直腸癌發(fā)生相關(guān)的基因進(jìn)行編輯，特異性很高，在研究結(jié)直腸癌發(fā)生發(fā)展機制中具有獨特的優(yōu)勢。在這里，小編將介紹一些最常用的基因工程小鼠結(jié)直腸癌模型供大家參考。

Apc^Min小鼠

????Apc基因是Wnt途徑中重要的抑癌基因，對結(jié)直腸癌腫瘤的發(fā)生發(fā)展起到重要作用。ApcMin小鼠[4]是通過ENU誘變篩選出來的一個小鼠品系，其Apc基因編碼亮氨酸的第850號密碼子(TTG)轉(zhuǎn)變成終止密碼子(TAG)，從而提前截斷蛋白，Apc失去抑癌作用。ApcMin小鼠純合子胚胎致死，低齡雜合子小鼠可在整個腸道中生長出超過30個腺瘤，大多數(shù)在出生120天后死亡。ApcMin小鼠與人類家族性多發(fā)息肉病(familial adenomatous polyposis, FAP)表現(xiàn)相似，目前是用于FAP藥物開發(fā)的理想模型。

Apc ^flox小鼠

除了全身性Apc基因的突變，現(xiàn)在還可以通過基因修飾手段，實現(xiàn)特定時間或特定組織Apc基因的失活。例如可以通過在Apc flox小鼠[5]腸粘膜下注射表達(dá)Cre重組酶的慢病毒或腺病毒，達(dá)到定時在大腸中刪除Apc基因的目的，從而抑制β連環(huán)蛋白的條件表達(dá)，導(dǎo)致結(jié)直腸息肉的形成。該模型具有腫瘤發(fā)生率高及可預(yù)測性等特點，能很好地模擬臨床FAP綜合征。

MMR相關(guān)基因敲除小鼠

MMR是DNA錯配修復(fù)系統(tǒng)，其相關(guān)任一基因的突變，都會使細(xì)胞錯配修復(fù)功能缺陷，結(jié)果導(dǎo)致DNA復(fù)制錯誤或微衛(wèi)星不穩(wěn)定，進(jìn)而誘發(fā)人類遺傳性非息肉性大腸癌（HNPPC）。在小鼠身上敲除Mlh-1或Mlh-2基因（兩種MMR相關(guān)基因），其淋巴細(xì)胞會發(fā)生瘤變，同時也非常容易發(fā)生胃腸道腫瘤，是研究HNPPC的理想模型。其中Mlh-2基因敲除小鼠純合子還會伴有Apc基因的失活。

其他基因工程小鼠

Villin-KrasG12D轉(zhuǎn)基因小鼠[6]采用Villin啟動子驅(qū)動KrasG12D表達(dá)，可以在Apc未突變的情況下誘發(fā)侵襲性結(jié)腸腺癌。CDX2P-G22Cre; Kras?LSL-G12D雙陽性小鼠[6]發(fā)生隱窩結(jié)構(gòu)改變及結(jié)腸上皮增生，是研究增生性腸息肉的理想模型。Kras LSL-G12D；Smad4 flox/flox小鼠，在其腸粘膜下注射表達(dá)Cre的慢病毒，將誘導(dǎo)小鼠腸上皮細(xì)胞突變進(jìn)而形成癌灶，可以模擬臨床散發(fā)性結(jié)直腸癌。

以上所介紹的基因工程小鼠結(jié)直腸癌模型在研究腫瘤發(fā)生的分子機制、病理機制及抗癌藥物篩選中有著至關(guān)重要的作用，其形成腫瘤的形態(tài)特征與人腫瘤自然發(fā)生極為相似，目前正成為結(jié)直腸癌領(lǐng)域中必不可少的研究工具。

南模生物有包括結(jié)直腸癌在內(nèi)多個癌種的小鼠腫瘤模型，并且可根據(jù)客戶的研發(fā)需要提供誘發(fā)性腫瘤小鼠模型、基因工程小鼠腫瘤模型定制、PDX模型以及各類基于細(xì)胞系的異體移植腫瘤模型服務(wù)。

我們可以構(gòu)建各類皮下，原位或者轉(zhuǎn)移瘤模型，并針對相應(yīng)的模型提供高度定制化的體內(nèi)藥效學(xué)服務(wù)。

References

1?Freddie B , Jacques F , Isabelle S , et al. Global Cancer Statistics 2018: GLOBOCAN Estimates of Incidence and Mortality Worldwide for 36 Cancers in 185 Countries[J]. CA: A Cancer Journal for Clinicians, 2018.

2?Nguyen D X , Bos P D , Massagué, Joan. Metastasis: from dissemination to organ-specific colonization[J]. NATURE REVIEWS CANCER, 2009, 9(4):274-284.

3?Fazio V M , Robertis M D , Massi E , et al. The AOM/DSS murine model for the study of colon carcinogenesis: From pathways to diagnosis and therapy studies[J]. Journal of Carcinogenesis, 2011, 10(1):9.

4 Su L K , Kinzler K W , Vogelstein B , et al. Corrections and Clarifications: Multiple Intestinal Neoplasia Caused By a Mutation in the Murine Homolog of the APC Gene[J]. Science, 1992, 256(5060):1114-1114.

5 Robanus-Maandag EC, Koelink PJ, Breukel C, , et al. A new conditional Apc-mutant mouse model for colorectal cancer[J]. Carcinogenesis,2010, 31(5):946-52.

6 Rustgi AK. BRAF: A Driver of the Serrated Pathway in Colon Cancer[J]. Cancer Cell, 2013, 24(1):1-2.