我們通過不同的方法對小鼠特定基因進(jìn)行靶向編輯或修飾，從而獲得可遺傳的基因缺失(lossof function)或基因獲得(gain of function)小鼠模型，并對它們的發(fā)育、形態(tài)學(xué)、生理學(xué)、病理學(xué)等各方面展開研究。開發(fā)和研究基因修飾小鼠的目的之一，就是解決后基因組時代小鼠遺傳學(xué)的主要問題：為小鼠基因組中的每個基因分配一個功能。

?

在我們使用基因工程小鼠模型進(jìn)行課題研究的時候，離不開兩個關(guān)鍵詞。

• Genotype（基因型）

• Phenotype（表型）

?

改變目標(biāo)基因（Genotype），可能會導(dǎo)致小鼠某些生理過程的變化（Phenotype），從而推斷目標(biāo)基因的功能。Genotype是因，Phenotype是果。

明確目標(biāo)基因發(fā)生改變的過程叫Genotyping（基因型鑒定）。對于基因工程小鼠模型來說，就是區(qū)分野生型和突變型。發(fā)現(xiàn)并評估小鼠生理變化的過程叫Phenotyping（表型分析）。Genotyping是成就“因果關(guān)系”的基石。如果Genotyping出現(xiàn)差錯，那么后續(xù)所有的Phenotyping都將謬以千里。

?

關(guān)于Genotyping，你大概需要知道以下這些事情。

?

高質(zhì)量的小鼠基因組DNA

隨著基因編輯技術(shù)的發(fā)展，敲除或插入的基因片段越來越大、人為改造的基因結(jié)構(gòu)越來越復(fù)雜，因此對小鼠基因組DNA模板的質(zhì)量要求也隨之提高。過去為了快速得到基因型結(jié)果，采用簡單的堿變性快速抽提?DNA方法，可以應(yīng)付一些短片段的PCR鑒定。但這樣獲得的DNA 比較“臟”，很容易發(fā)生鑒定不出結(jié)果的情況?；蛘呤褂靡恍┲苯?PCR 擴(kuò)增試劑盒（例如：將鼠尾在試劑中浸泡20分鐘后取上清直接作為模板），由于試劑盒選擇的種類比較多，不同廠家的試劑盒擴(kuò)增效率也不一樣，因此也常常發(fā)生鑒定結(jié)果不理想的情況。

?

綜合時間成本與成功率兩大因素，利用裂解液加蛋白酶K配方裂解鼠尾，釋放 DNA，并通過酒精沉淀的方法得到純度較高的DNA，是高效簡便的小鼠基因組 DNA 制備方法。

鼠尾樣本基因組抽提Protocol

• 蛋白酶K貯存液的配制：

用超純水徹底溶解蛋白酶K粉劑, 使終濃度為10mg/ml，分裝成1ml/vial, -20度保存。

• 裂解液的主要成分：SDS、EDTA、Tris/HCl、NaCl。

• 小鼠尾基因組DNA提取步驟：

（1）剪取小鼠尾端約0.5厘米（視鼠齡及鼠尾粗細(xì)可調(diào)整, 盡量使鼠尾體積相互接近），將鼠尾放入已編號1.5ml離心管中并蓋好蓋子。

（2）每管加0.5ml裂解液和50μl蛋白酶K貯存液并將蓋蓋緊。

（3）將離心管置于雜交管中并用紙團(tuán)稍加固定。

（4）將離心管置雜交爐中，56℃轉(zhuǎn)動過夜。

（5）次日將樣本于室溫，12000rpm離心 10分鐘。

（6）上清倒入1.5ml 離心管中，加1ml 無水乙醇（約2倍上清體積），蓋緊蓋子后輕搖，可見絮狀沉淀。13000rpm, 15min,棄上清。

（7）加70%乙醇1ml，洗滌，13000rpm離心10~15min，棄上清，收集沉淀，室溫晾10~15min。

（8）每管加80~100μl 滅菌水，蓋好后置室溫或37℃ 1小時充分溶解。在室溫中放置數(shù)小時，待DNA全部溶解后-20℃保存，或直接進(jìn)行PCR或雜交等實(shí)驗(yàn)。如DNA溶解不完全,在37℃水浴中放置30~60min，但不可過夜。DNA樣品的OD260/280在1.8-2.0之間。

• 注意：

裂解鼠尾一定要充分，有條件盡量使用雜交爐。因?yàn)槿绻呀膺^程中組織與裂解液始終保持靜止，而沒有翻轉(zhuǎn)的過程，這會導(dǎo)致DNA和鼠毛之類的雜質(zhì)沒有完全分開。離心去除雜質(zhì)的過程中，DNA就會隨著這些雜質(zhì)一起被拋棄了。

?

常用的Genotyping方法

聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）+凝膠電泳

基因工程小鼠基因型PCR 鑒定的基本原則是利用基因工程小鼠基因組與野生型小鼠基因組的序列差異，以小鼠基因組DNA為模板進(jìn)行PCR，并以凝膠電泳對比不同基因型特異產(chǎn)物的大小（一般差異在100bp以上），根據(jù)電泳條帶差異來直接區(qū)分小鼠的不同基因型。

?

適用于：

Knockout（包括CRISPR介導(dǎo)片段敲除）

Conditional knockout

Knock-in（片段敲入）

?

常規(guī)PCR電泳結(jié)果示意圖：

?

PCR+酶切或測序

如果目標(biāo)基因突變的堿基數(shù)很少，很難通過PCR產(chǎn)物大小來直接區(qū)分，那么有以下幾種方法來鑒定基因型。

1） 對于多個堿基連續(xù)突變的情況，可以采用三引物的方法，一條為共用引物，另外兩條為差異引物。這兩條差異引物的3’端設(shè)計在發(fā)生突變的區(qū)域，利用針對野生型引物只能擴(kuò)增出野生型條帶，針對突變型引物只能擴(kuò)增出突變型條帶的原理，區(qū)分野生型、雜合子和純合子基因型。這種方法受引物設(shè)計位點(diǎn)的限制、同時對PCR條件的要求很高，較易出現(xiàn)假陽性情況，因此不太實(shí)用。

2）可以利用突變前后酶切位點(diǎn)的改變，通過對比酶切產(chǎn)物來區(qū)分基因型。該方法僅限突變產(chǎn)生了新的酶切位點(diǎn)或?qū)е略械拿盖薪Y(jié)果條帶大小發(fā)生明顯變化。操作起來比較繁瑣，同樣也有假陽性、假陰性的情況。

3）可以采用TA克隆和測序的方法，通過測序峰型圖來判斷（如下圖所示）。幾乎適用于所有點(diǎn)突變情況，而且結(jié)果可靠性高，是性價比非常高的鑒定方法。

?

適用于：?

Knockout?（CRISPR介導(dǎo)NHEJ產(chǎn)生Indel）

Point?mutation（CRISPR介導(dǎo)HDR）

?

Knockout小鼠模型測序結(jié)果示意圖（CRISPR介導(dǎo)NHEJ產(chǎn)生Indel）：

如下圖所示，圖A為野生型小鼠PCR 產(chǎn)物測序峰圖。圖B為陽性F0 代小鼠基因型鑒定PCR 產(chǎn)物測序峰圖。CRISPR/Cas9 作用后，由于發(fā)生NHEJ隨機(jī)修復(fù)，產(chǎn)生多種基因型，在Cas9 切點(diǎn)附近出現(xiàn)雜峰。圖C為陽性F1 代小鼠基因型鑒定PCR 產(chǎn)物測序峰圖。陽性F1 小鼠基因組一個拷貝是野生型，一個拷貝是突變體，在Cas9 作用位點(diǎn)附近區(qū)域測序有后雙峰現(xiàn)象（兩種基因型產(chǎn)生了兩種峰型）。圖C’ 和圖C”是圖C中測序PCR 產(chǎn)物連接T-vector 后，單克隆測序結(jié)果。其中，圖C’ 為野生型，圖C” 為突變體。峰型對比可以發(fā)現(xiàn)C” 較C’ 缺失了兩個堿基CC。C’ 和C” 峰型結(jié)果可以和C 圖峰型結(jié)果向吻合。

?

Point?mutation小鼠模型測序結(jié)果示意圖（CRISPR介導(dǎo)HDR）：

如下圖所示，圖A為野生型小鼠PCR 產(chǎn)物測序峰圖。圖B為陽性F0 代小鼠基因型鑒定PCR 產(chǎn)物測序峰圖。CRISPR/Cas9 作用后，由于發(fā)生同源重組修復(fù)(HR) 的同時，也可能發(fā)生非同源重組修復(fù)(NHEJ)。因此，切點(diǎn)附件可能出現(xiàn)雜峰。圖C為陽性F1 代小鼠基因型鑒定PCR產(chǎn)物測序峰圖。陽性F1 小鼠基因組一個拷貝是野生型，一個拷貝是突變體，在Cas9 作用位點(diǎn)附近區(qū)域測序，突變點(diǎn)位置有雙峰現(xiàn)象（野生型和突變體，兩種基因型產(chǎn)生了兩種峰型）。圖C’ 和圖C” 為圖C中測序PCR 產(chǎn)物鏈接T-vector 后，單克隆測序結(jié)果。其中，C’為野生型，C” 為突變體。峰型對比可以發(fā)現(xiàn)C” 較C’ 的目的突變點(diǎn)CCT 突變?yōu)镚TT，C’ 和C” 峰型結(jié)果可以和C 圖峰型結(jié)果相吻合。

?

?

常用Genotyping引物設(shè)計方案

Knockout小鼠模型（片段敲除）

雙引物（一對）方案：分別在敲除片段的上下游各設(shè)計一條引物。下圖B為小鼠ES細(xì)胞打靶途徑的引物策略與PCR產(chǎn)物大小示意圖。下圖C為CRISPR途徑的引物策略與PCR產(chǎn)物大小示意圖。

?

Conditional knockout小鼠模型

雙引物（一對）方案：可以分別在flox區(qū)域上下游各設(shè)計一條引物。下圖為小鼠ES細(xì)胞打靶途徑的引物策略與PCR產(chǎn)物大小示意圖。圖A可鑒定flox小鼠中Neo基因是否被去除；圖B則示意了在特定組織中flox區(qū)域是否被敲除。CRISPR途徑構(gòu)建的CKO小鼠模型的引物設(shè)計策略也可參考下圖，去除frt-Neo-frt結(jié)構(gòu)。

Knock-in小鼠模型（片段敲入）

四引物（兩對）方案：小鼠ES細(xì)胞打靶途徑或CRISPR途徑構(gòu)建的KI小鼠模型，都可以參照以下策略來設(shè)計鑒定引物。第一對引物分別設(shè)置在敲入位點(diǎn)上下游；第二對引物中的一條設(shè)計在敲入序列上，另一條設(shè)計在同源臂上。且兩對引物的PCR產(chǎn)物大小具有明顯差異。

Point?mutation小鼠模型（CRISPR途徑）

雙引物（一對）方案：針對包含點(diǎn)突變位置上下游共約300-800bp的區(qū)域設(shè)計PCR引物。獲得的PCR產(chǎn)物通過酶切或測序的方法判斷基因型。

?

成功PCR的小技巧

由于每個實(shí)驗(yàn)室、每臺PCR儀的實(shí)際條件不同，因此即使是被驗(yàn)證過的PCR體系，在不同的實(shí)驗(yàn)室中可能也會有不成功的情況。

以下幾點(diǎn)Tips也許可以幫你：

• 設(shè)計特異性高的引物。設(shè)計引物時，要進(jìn)行BLAST比對，從而盡量排除非特異性PCR產(chǎn)物出現(xiàn)的可能。

• 找到最適宜的退火溫度。一般可以通過梯度PCR的方法，對退火條件進(jìn)行摸索。退火溫度梯度可以設(shè)為引物對Tm值上下5?℃。Tm計算公式為：Tm = 4℃(G+C)+ 2℃(A+T)。如果沒有擴(kuò)增到預(yù)期的條帶，可以降低退火溫度幫助引物更有效地結(jié)合。如果非特異性條帶很多，則可以提高退火溫度來消除非特異性引物結(jié)合。

• 多引物對的PCR不成功時，需要分開優(yōu)化。如果PCR體系中存在多對引物同時反應(yīng)，而最終未能擴(kuò)增到PCR產(chǎn)物，那么要對每個引物對進(jìn)行單獨(dú)的PCR反應(yīng)，從而調(diào)整優(yōu)化整個體系。

• DNA過多或過少都會導(dǎo)致PCR不成功。一般模板濃度控制在50-100ng/μl 比較合適。

• 使用合適的PCR 酶。不同的 PCR 產(chǎn)物 GC 含量不一樣，遇見 GC 含量很高的產(chǎn)物往往常規(guī)的 PCR 酶沒法做出很好的結(jié)果。一般在定制的基因工程小鼠鑒定方案中會指出適合的 PCR 酶的貨號，按照已驗(yàn)證的方案以及推薦的酶體系，一般不會出錯。

?

對照的重要性

在一般的?Genotyping 里面，每一次鑒定都至少要設(shè)置一個 WT Control 和一個 H2O，也就是 Blank Control。

WT Control

1）幫助我們快速判斷基因型。在 Flox 小鼠或片段 knockin 小鼠的鑒定中，如果產(chǎn)物條帶僅有一條或其中有一條與 WT Control 一致，那么可以判斷該樣本為 WT 或 雜合子。

2）幫助我們判斷 PCR 體系是否 work。如果 PCR 產(chǎn)物在跑電泳的時候連WT Control 的樣品都沒有出條帶，那么說明 PCR 體系有問題，需要做相應(yīng)的調(diào)整，比如考慮更換引物或 PCR mix 等。

Blank Control

H2O 對照主要是用來質(zhì)控 PCR 體系是否發(fā)生了污染。如果 H2O 對照都有條帶，說明整個 PCR 體系存在污染的問題，這個 PCR 結(jié)果不可信。

Internal Positive Control

Internal Positive Control內(nèi)部對照引物通常擴(kuò)增與目的基因無關(guān)的基因組DNA區(qū)域。一般用在隨機(jī)插入轉(zhuǎn)基因小鼠的鑒定中。通常轉(zhuǎn)基因鑒定引物是只針對插入的外源 DNA 序列的，所以沒有發(fā)生隨機(jī)整合的小鼠 DNA 模板不會有 PCR 產(chǎn)物產(chǎn)生。這樣一來很容易發(fā)生假陰性的問題。也就是說電泳沒有條帶，我們無法判斷到底是外源基因未整合的陰性結(jié)果，還是由于 PCR 體系本身的問題造成陰性結(jié)果。所以需要另一對在所有小鼠中都能獲得 PCR 產(chǎn)物的陽性對照引物作為內(nèi)控，即Internal Positive Control，用于判定 PCR 體系和模板質(zhì)量是否合適。

?

如何消滅PCR污染

• 鼠尾取樣時，每一次剪鼠尾之前，都必須要用75%酒精擦拭清潔剪刀?；驕?zhǔn)備兩把剪刀輪流使用，用完的剪刀浸泡在75%酒精溶液中。

• 推薦用裂解液和蛋白酶K處理鼠尾后將DNA純化之后做PCR鑒定，這樣可以降低污染的概率。

• 在PCR實(shí)驗(yàn)前用75% 乙醇擦拭工作臺、移液槍表面、手套。

• PCR試劑的分裝。最好提前將去離子水、大包裝的緩沖液等PCR試劑分裝在1.5ml或1ml離心管中。避免原裝瓶反復(fù)使用引起的污染。

• 配置?PCR 反應(yīng)體系的過程中槍頭要及時更換。盡量使用帶有濾芯的槍頭。

• 加試劑時手握PCR管的中下部，盡量遠(yuǎn)離PCR管口，避免交叉污染。

• 用完的試劑管要及時蓋上蓋子。

• 配置完成后要仔細(xì)蓋緊PCR管蓋。特別是使用像8聯(lián)管這類PCR管，要檢查蓋子是否蓋緊，以免導(dǎo)致在PCR機(jī)器里時水分蒸發(fā)。另外，配置后要輕輕混勻PCR體系并短暫離心，以免試劑黏在試管壁上導(dǎo)致反應(yīng)不充分。

• 配制?PCR 反應(yīng)體系的實(shí)驗(yàn)臺盡量和 PCR 儀以及電泳槽分開，因?yàn)?PCR 儀和電泳槽附近的區(qū)域往往是高濃度 DNA 彌散的區(qū)域。

• 跑電泳過程中，上樣的槍頭最好及時更換。如果沒有更換，那么每次上完一個樣都要在電泳?buffer 中吹打清洗干凈。防止槍頭上帶有前一個樣品的產(chǎn)物，造成點(diǎn)樣的污染。

• 利用qPCR排除假陽性。在鑒定?Cre 和 Flp 這些轉(zhuǎn)基因小鼠的時候，可以嘗試通過熒光定量 PCR 做相對定量的方法來避免假陽性的問題。具體是指在熒光定量PCR的時候，同時鑒定目的基因和內(nèi)參基因，通過△Ct的方法來確定陽性產(chǎn)物，可以有效避免因?yàn)樯倭课廴驹斐傻募訇栃詥栴}。

?