Circulation│c-kit 細胞對成體心肌細胞貢獻的再評價
7月8日，國際學術期刊Circulation在線發(fā)表了中國科學院生物化學與細胞生物學研究所周斌研究組與中國醫(yī)學科學院阜外醫(yī)院心血管疾病國家重點實驗室聶宇課題組的最新科研成果“Reassessment of c-Kit+?Cells for Cardiomyocyte Contribution in Adult Heart”。
該研究利用雙同源重組系統(tǒng)(Cre-loxP和Dre-rox)構建了兩個可以有效標記Kit+細胞且不影響內源Kit基因表達的小鼠模型，并利用這些模型對Kit+的心臟干細胞(CSCs)是否參與成體心肌細胞的生成進行了探討。研究結果顯示，無論心臟處于穩(wěn)態(tài)或損傷狀態(tài)下，都不會參與新生的心肌細胞的生成。?
南模生物為該研究構建了Kit-2A-Cre和Kit-IRES-Cre;Tnnt2-DreER這兩個小鼠模型。
限于之前的小鼠模型無法有效追蹤CSCs的命運，Kit+?CSCs是否具有肌源潛能一直存在爭議[1-3]。去年發(fā)表在Nature上的一篇文章對已有的Kit-Cre模型進行了總結，并概括了現(xiàn)有模型的兩大缺陷：1)構建時同源重組酶Cre取代了內源Kit基因的表達，從而引發(fā)單倍體不足(haploinsufficiency)，即單個Kit等位基因不足以維持其正常功能；2)無法標記Kit表達量低的細胞。
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為了解決Kit+?CSCs是否具有肌源潛能這一問題，本研究另辟蹊徑，構建了2個全新的Kit-Cre工具鼠品系(Fig.1)。為了避免對c-Kit基因產生影響，研究人員選擇將Cre插入到Kit的最后一個外顯子后，并通過2A或者IRES元件分隔，從而實現(xiàn)與內源Kit共同表達的目的。
Fig.1 Schematic figure showing knock-in strategies for Kit-2A-Cre or Kit-IRES-Crealleles by homologous recombination.
Kit2A-Cre/2A-Cre?和 KitIRES-Cre/IRES-Cre純合子小鼠可以正常存活至成年，檢測野生型、純合子、雜合子小鼠在大小、體重以及心臟大小、體重占比、功能等生理指標均沒有差別，并且Kit在純合小鼠中表達完整(Fig.2)。
Fig.2 Immunostaining for c-Kit on heart sections show its expression in tissues ofall groups (12–16W).
為了確定同時標記Kit+細胞和心肌細胞，研究人員首先選擇用心肌細胞特異表達的Tnnt2基因標來記心肌細胞，為此構建了Tnnt2–DreER小鼠模型。隨后通過Kit–2A-Cre;R26–GFP，Tnnt2–DreER;R26–rox–tdTomato交配，利用Cre-loxP和Dre-rox雙同源重組系統(tǒng)，將Kit+細胞標記為綠色，將心肌細胞標記為紅色，這樣就可以從Kit+細胞中區(qū)別出非心肌細胞(GFP+tdTomat-)和心肌細胞(GFP+tdTomato+)(Fig.3)。
Fig.3 Strategy for labeling of?Kit+?cells by dual recombinases-based system.
那么GFP+tdTomat-的非心肌細胞是否會產生維持GFP+tdTomat-的新生心肌細胞呢？
在小鼠心肌梗死(MI)兩周前進行他莫昔芬誘導，MI四周后進行組織采樣檢測(Fig.4)，觀察發(fā)現(xiàn)GFP+tdTomato+心肌細胞分布于梗死及梗死邊緣位置，但是在所有的組織切片中都沒有觀察到GFP+tdTomato-心肌細胞，說明心肌梗死后Kit+非心肌細胞不參與新生心肌細胞的生成。
Fig.4 Immunostaining for green fluorescent protein (GFP), tdTomato, and Troponin I(TNNI3) on myocardial infarction (MI) heart sections.
利用Kit–IRES–Cre模型替換Kit-2A-Cre模型重復該研究(Fig.5)，得到的也是相同的結果。
Fig.5 Immunostaining for GFP, tdTomato, and TNNI3 on MI heart sections.
本研究將兩個新的Kit-Cre模型與雙同源重組酶介導的譜系追蹤策略結合，追蹤kit在成體心臟中的命運，回避了Kit-Cre譜系追蹤問題；不同于以前的Kit-Cre模型，新的Kit-Cre模型不存在Kit單倍體不足的問題，同時標記所有Kit+細胞及其后代。
本研究解決了已有Kit-Cre模型的兩大缺陷，間接證明了內源的Kit+CSCs不是成體心臟心肌更新和修復所必需的。
南模生物提供全方位模式生物服務，包括模型定制服務、成品模型、飼養(yǎng)繁育、表型分析、藥物篩選，可提供小鼠、大鼠、斑馬魚及線蟲模型，滿足不同實驗室需求。
References
1.Ellison GM, Vicinanza C, Smith AJ, Aquila I,?et al.Adult c-kit+ cardiac stem cells arenecessary and sufficient for functional cardiac regeneration and repair.?Cell.2013;154:827–842. doi: 10.1016/j.cell.2013.07.039
2.van Berlo JH, Kanisicak O, Maillet M,?et al.c-kit+ cells minimally contribute cardiomyocytes to theheart.?Nature. 2014;509:337–341. doi: 10.1038/nature13309
3.Vicinanza C, Aquila I, Cianflone E, Scalise M, Marino F,??et al.?KitCre knock-in mice fail to fate-map cardiac?stem cells.Nature. 2018;555:E1–E5.doi: 10.1038/nature25771
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