2018年9月24日，Nature Protocols發(fā)表了中科院生物化學與細胞生物學研究所周斌研究員課題組的文章“Genetic lineage tracing of resident stem cells by DeaLT”，詳細描述了如何利用DeaLT這種新型譜系示蹤系統(tǒng)來進行細胞命運與組織發(fā)育的研究。

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關注譜系示蹤領域研究或經(jīng)?？次覀児娞栁恼碌淖x者應該對譜系示蹤這個概念并不陌生了。在器官發(fā)育、疾病進展和組織再生的過程種，細胞經(jīng)常通過感知環(huán)境變化并經(jīng)過分化或轉分化而走上不同的命運。通過譜系示蹤技術，我們可以更好地解開細胞的起源問題、認識細胞的可塑性。

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目前在體內追蹤細胞命運轉化的技術中，最被廣泛使用的就是Cre-loxP介導的譜系示蹤。利用表達Cre的細胞中的Cre-loxP重組可以去除插入到小鼠Rosa26位點中的loxP側翼的轉錄終止結構，使隨后的報告基因表達（如GFP和tdTomato）。這種方法通常能夠揭示不同細胞類型之間的關系。

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Cre還可以被解構成兩部分，分別由兩種不同的啟動子控制，達到加強遺傳靶向特異性的目的。方法是：Cre重組酶的編碼序列被分成兩個互補的片段：NCre和CCre。 NCre表達在一種啟動子下控制，CCre在另一種啟動子的控制下。僅在這兩種不同的啟動子均激活的細胞中，NCre和CCre表達構成完整的Cre，隨后行使Cre-loxP重組功能，驅動報告基因表達，進行譜系示蹤。因為Cre重組酶表達受兩個啟動子的控制，所以這種譜系追蹤的特異性較最簡單的單一啟動子系統(tǒng)要強一些。

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盡管如此，傳統(tǒng)的Cre-loxP介導的遺傳譜系追蹤仍不能解決許多爭議性科學問題。例如，內源性c-Kit+心臟干細胞（CSCs）是否具有肌源性潛力？乳腺干細胞是單能干細胞還是雙能干細胞？Sox9 +導管細胞是否是兼性肝細胞祖細胞？β-細胞是來自于內分泌祖細胞還是通過自我擴張再生而來？等等等等。

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瓶頸在于：在干細胞和組織再生領域，許多已發(fā)現(xiàn)的干細胞標記物對干細胞群而言并不是特異的，它們也可能由一些子細胞亞群表達。而傳統(tǒng)技術的準確性主要依賴于 Cre 表達的特異性，如果有微量的 Cre 表達在了非靶向細胞中即為所謂的異位表達，那么最終被標記的后代細胞既有可能是靶向細胞來源，也有可能是非靶向細胞來源，從而干擾對 兩種不同細胞類型命運和起源的追蹤，使譜系示蹤結果的可靠性大大降低。

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如何突破這個瓶頸呢？

目標就是消除異位表達。由于Cre-loxP重組需要兩個loxP位點同時存在才會發(fā)生，那么如果能夠在非靶向細胞中去除其中一個loxP位點，不就可以阻止非靶標細胞中的重組反應，防止非特異性標記的發(fā)生了嗎？

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DeaLT（Dual-recombinase-activated lineage tracing）譜系示蹤技術就是利用這個思路，將?Dre-rox 重組系統(tǒng)引入到傳統(tǒng)的 Cre-loxP 重組系統(tǒng)中來，用一個重組系統(tǒng)（Dre-rox）來控制另一個系統(tǒng)（Cre-loxP）。Dre-rox 介導的重組反應在可能引起 Cre 異位表達的細胞中將loxP 位點切除掉，有效阻止Cre-loxP 的異位重組，增加Cre-loxP 介導的譜系示蹤結果的準確性。

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通過基因打靶技術，可以建立一種兩套系統(tǒng)交錯的報告基因小鼠品系（IR1）：?在Rosa26位點中，兩個 loxP 位點和兩個 rox 位點以交錯形式存在（loxP-rox-loxP-rox），如下圖1a所示：

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使用組成型?Dre工具鼠品系與誘導型?CreER工具鼠品系與IR1交配，使得先發(fā)生Dre-rox重組，而誘導型重組僅在他莫昔芬誘導后在CreER+Dre-的細胞中起作用。換句話說，在表達Dre的細胞中阻止Cre-loxP重組（圖1b）。

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Fig. 1?| a, Construction of interleaved reporter 1 (IR1).b, In Tnni3–Dre;Kit-CreER;IR1 (DeaLT) mice, Tnni3–Dre–rox recombination labels cardiomyocytes (cell B) with tdTomato. After tamoxifen treatment, Kit-CreER-loxP recombination labels Kit+ CSCs (cell A) with ZsGreen, whereas cardiomyocytes remain labeled with tdTomato+. CAG, CAG promoter, hybrid construct consisting of the cytomegalovirus (CMV) enhancer fused to the chicken beta-actin promoter; frt, flippase recognition target site; Neo, neomycin; pA, poly(A) tail; STOP, transcriptional stop codon; WPRE, woodchuck hepatitis virus post-transcriptional regulatory element.

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DeaLT的優(yōu)點

提供了同時追蹤兩種細胞類型的方法，可在體內同時追蹤不同的細胞群。

更精準的譜系示蹤。

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DeaLT的缺點

與傳統(tǒng)Cre-loxP單系統(tǒng)相比，DeaLT系統(tǒng)需要用到3種基因工程小鼠(Dre;Cre;IR1)。

小鼠的構建、飼養(yǎng)和繁育工作更為復雜、漫長。

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DeaLT的關鍵點：Dre的特異性和效率：

驅動Dre的啟動子的特異性以及Dre的工作效率對于確保精確控制靶細胞中Cre-loxP重組至關重要。并不是所有分化細胞類型的啟動子（圖1中的細胞B）都適合，因此，在建立DeaLT三基因陽性小鼠之前，必須根據(jù)現(xiàn)有文獻和數(shù)據(jù)來選擇合適的啟動子，并先通過與IR1雜交來對Dre品系進行表型分析與驗證。

B-Dre的效率必須很高（接近100％），因此需要選擇強而特異的啟動子來驅動Dre重組酶表達。B-Dre小鼠必須與R26-rox-stop-rox-tdTomato報告基因小鼠交配來測試Dre的效率。只有在驗證Dre足夠高效以后，才能與Cre; IR1雙陽性小鼠雜交，用于DeaLT系統(tǒng)的建立并進行譜系示蹤。

Dre的表達必須是B細胞特異的。DeaLT只能標記A+B-細胞群并鑒定B細胞群中的干細胞。如果A+干細胞也表達B，B-Dre-rox重組將阻止A+群體中的Cre-loxP重組，因此DeaLT不能使這種特異性干細胞群（A+B+細胞）被標記。

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如何利用DeaLT技術來追蹤某種潛在干細胞呢？

以c-Kit+心臟干細胞（CSCs）為例，我們來看看用DeaLT系統(tǒng)使如何回答這類細胞是否具有肌源性潛力的問題的。

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A類細胞（標志物為gene?A）表示c-Kit+干細胞，細胞B（標志物為geneB）表示心肌細胞。Kit基因（gene?A）在c-Kit+干細胞中高表達，但在心肌細胞中也有少量表達。因此要排除由于Kit-CreER在心肌細胞中的表達而對c-Kit+心肌細胞進行的非靶向性標記。

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要追蹤一種潛在干細胞，一共需要建立3種基因工程小鼠品系：B-Dre (Tnni3–Dre)、A-CreER ?(Kit-CreER) 和?IR1，經(jīng)過3個階段的實驗：

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第一階段：工具鼠的建立與驗證

首先，針對兩種新的重組酶工具鼠B-Dre (Tnni3–Dre) 和A-CreER ?(Kit-CreER)，我們需要分別進行重組酶活性和特異性的驗證，并排除Dre–loxP 和Cre–rox交叉識別的可能性，排除CreER的漏表達。

重組酶工具鼠的建立

• 推薦采用周期更短的CRISPR基因編輯技術來制備B-Dre重組酶工具鼠，一般僅需6個月。而傳統(tǒng)ES細胞打靶途徑可能需要1-2年。

• 在設計基因工程小鼠時，建議在Dre?cDNA之后加上WPRE元件來增加mRNA表達的穩(wěn)定性，提高Dre蛋白的表達效率和重組效率。

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Dre?和 CreER 工具鼠的驗證

• 重組效率：>99%

分別與IR1小鼠交配，檢測報告基因表達情況。在A-CreER;IR1中，如果他莫昔芬誘導一次效果不佳，可進行多次反復誘導，以明確能實現(xiàn)高效標記的誘導次數(shù)，方法是：最好有一種特異性c-Kit（gene?A）抗體，首先檢測內源性c-Kit蛋白表達，然后在最后一劑他莫昔芬后（在一至五次他莫昔芬處理后）1-2天采集Kit-CreER; IR1小鼠的心臟，并用Kit抗體和ZsGreen抗體對心臟切片進行免疫熒光染色，檢測Kit +細胞中ZsGreen +細胞的百分比。對于Kit-CreER; IR1小鼠，有效的誘導方式是：每2天經(jīng)口給予小鼠他莫昔芬，共5次。如果沒有好用的Kit抗體，那么就需要閱讀相關文獻，找到由Kit-CreER標記的報告的細胞類型（例如，內皮細胞）。選擇好的一抗進行免疫染色至關重要，建議購買并使用已在已發(fā)表研究中使用的相同抗體，并在不同稀釋度的樣品上進行測試，以確定最佳條件。

• 特異性重組

分別與IR1小鼠交配，通過marker分子和熒光蛋白進行免疫染色評估，確定Tnni3-Dre (B-Dre) 是否僅在TNNI3+心肌細胞中激活報告基因表達，而Kit-CreER (A-CreER) 僅在c-Kit+中激活報告基因表達。

值得注意的是，在對Tnni3-Dre進行表型分析時，心臟中存在的其他細胞類型（例如，內皮細胞，平滑肌細胞和成纖維細胞）或其他器官（例如，肝，肺和腦）應當用作內部對照。 實驗結果應證實Tnni3-Dre標記心肌細胞但不標記其他細胞譜系。 在對Kit-CreERe進行表型分析時，應查閱文獻以確定c-Kit是否在其他細胞類型中表達。 例如，c-Kit在肺內皮細胞中表達但在上皮細胞中不表達，因此可以收集肺組織用于對照。

• Dre–loxP 或?Cre–rox交叉識別排查

例如，Tnni3–Dre;IR1小鼠中，如果在心肌細胞中有tdTomato紅色熒光信號說明Dre-rox重組，如果有ZsGreen綠色熒光信號說明發(fā)生了Dre–loxP交叉串擾重。

• 誘導型CreER的漏表達排查

Cre漏表達是指在沒有他莫昔芬誘導的情況下發(fā)生CreER-loxP重組。主要需要考察在早期胚胎階段Kit-CreER是否存在泄漏。?如果Kit-CreER在早期胚胎階段在心肌細胞中漏表達，那么在Tnni3-Dre發(fā)揮作用去除這些細胞中的loxP位點之前，就會觀察到CreER的漏表達重組作用。對于所有CreER工具鼠，都需要一組未接受他莫昔芬的對照組來檢查CreER漏表達的情況。

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第二階段：DeaLT系統(tǒng)的建立

隨后，將B-Dre (Tnni3–Dre)、A-CreER ?(Kit-CreER) 和?IR1交配到一起，獲得Tnni3–Dre;Kit-CreER;IR1三基因敲入小鼠。在適當?shù)臅r間誘導Cre重組，通過IR1中的不同熒光報告基因標記不同的細胞類型：ZsGreen熒光蛋白標記c-Kit +干細胞，tdTomato熒光蛋白標記小鼠心臟中的心肌細胞。

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• 要獲得DeaLT 三基因敲入小鼠（Tnni3–Dre;Kit-CreER;IR1 mice）可以先獲得Tnni3–Dre;Kit-CreER雙陽性，再與IR1小鼠交配；也可以先將一種重組酶工具鼠與IR1小鼠交配，再與另一種工具鼠交配。整個交配過程大約需要6個月左右。

• 在DeaLT小鼠出生后，幾乎所有的心肌細胞都被Dre-rox系統(tǒng)標記。

• DeaLT和對照小鼠的年齡，體重和性別應該相匹配，每組至少需要3只或更多小鼠。

• 給予最后一劑他莫昔芬至少1周以后，收集DeaLT和對照小鼠的心臟進行冷凍切片和免疫染色。使用針對ZsGreen，tdTomato和TNNI3或VE-CAD的抗體。

• 在DeaLT小鼠心臟中，心肌細胞應該是tdTomato+ TNNI3+而不是ZsGreen +。在對照小鼠心臟中可以檢測ZsGreen+TNNI3+心肌細胞。

• 此外，DeaLT和對照小鼠心臟之間ZsGreen + VE-CAD+內皮細胞的百分比應該沒有實質性差異?？梢允褂梅谓M織作為額外的對照，因為c-Kit也在肺內皮細胞中表達，并且TNNI3不在肺組織中表達。

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第三階段：組織損傷和再生場景下的譜系示蹤

利用由冠狀動脈結扎引起的心肌梗塞（MI）（與假手術一起作為實驗對照）誘導細胞命運轉變。通過檢測c-Kit+ CSC（ZsGreen+）是否在MI后損傷的心肌中產(chǎn)生新的心肌細胞， DeaLT系統(tǒng)，相較常規(guī)策略（使用Kit-CreER; IR1），能夠更精確地追蹤c-Kit+干細胞。

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• 在任何實驗中，DeaLT和同窩對照小鼠都應在一起進行比較。

• 在成年階段多次給予他莫昔芬誘導，在最后一劑他莫昔芬誘導后2周，對小鼠進行MI或假手術。

• 在假手術中，所有手術都與MI病例相同，只是在假手術中不進行永久性動脈結扎。

• 對于損傷模型，建議每組有五只或更多的小鼠作為樣本。

• 一般來說，1-2周足以使他莫昔芬代謝，不過不同組織的他莫昔芬代謝時間不盡相同，建議在最后一劑他莫昔芬誘導后，留出2周或更長時間再進行損傷或疾病誘導。

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疑難排查

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