6月12日，國際學(xué)術(shù)期刊Circulation Research?在線發(fā)表了中國科學(xué)院生物化學(xué)與細胞生物學(xué)研究所周斌研究組的最新科研成果“Genetic Tracing Identifies Early Segregation of the Cardiomyocyte and Non-Myocyte Lineages”。

該研究利用雙同源重組系統(tǒng)（Cre-loxP和Dre-rox）結(jié)合多種小鼠胚胎發(fā)育模型揭示了胚胎期非心肌細胞向心肌細胞轉(zhuǎn)化[nonmyocyte to cardiomyocyte conversion (NMC)]現(xiàn)象出現(xiàn)的精準時間節(jié)點及新生期心臟再生的細胞機制。

研究發(fā)現(xiàn)NMC發(fā)生時間主要在胚胎發(fā)育的第8天至10.5天期間，11.5天之后再無NMC現(xiàn)象出現(xiàn)，且新生期心肌細胞的再生主要是通過原有心肌細胞的增殖而非通過NMC實現(xiàn)。該工作極大豐富了心臟干細胞的研究維度，并一定程度揭示了心臟發(fā)育或再生的重要機制。

該研究核心數(shù)據(jù)所采用的基因工程小鼠幾乎全部由南模生物提供，包括R26-LDLZ，Tnnt2-Cre，Myh6-IRES-Cre，R26-DreER，Tnnt2-Dre，Kit-CreER，IR3，NR2等。

心臟作為脊椎動物最重要的器官之一，主要功能是為血液流動提供動力。心臟是由多細胞構(gòu)成的，心肌細胞只占細胞總數(shù)量的30%，其余均為非心肌細胞。心肌細胞及其周圍的非心肌細胞共同執(zhí)行著心臟的功能。

早期研究認為心臟主要來源于原條中胚層，隨后發(fā)現(xiàn)的第二新區(qū)提示在心臟發(fā)育過程中，可能有多個來源的細胞參與心肌細胞的形成。目前尚不清楚的是，在這其中非心肌細胞向心肌細胞轉(zhuǎn)化（NMC）潛能如何，以及兩類細胞何時發(fā)生譜系分離。

為了同時對心肌細胞和非心肌細胞進行遺傳標記，研究人員通過小鼠交配獲得三基因小鼠Tnnt2-Cre; R26-LDLZ(CAG-loxp-DreERT2-stop-loxp-ZsGreen-polyA); R26-RSR-tdTomato。

利用Cre-loxP和Dre-rox雙同源重組系統(tǒng)，將心肌細胞特異型標記為綠色，在他莫昔芬誘導(dǎo)的情況下，將非心肌細胞標記為紅色，且是永久性標記，意味著若非心肌細胞轉(zhuǎn)化成心肌細胞，則在出現(xiàn)綠光的同時會繼續(xù)呈現(xiàn)紅色，雙色疊加即為黃色，通過觀察黃色熒光細胞則可以確定哪些心肌細胞是由NMC而來（Fig1）。

Fig1 Schematic figure showing strategy for labeling of TNNT2+?cardiomyocytes (ZsGreen+) and TNNT2-?non-cardiomyocytes (tdTomato+).

研究人員通過在小鼠胚胎期不同時間對三基因小鼠使用他莫昔芬誘導(dǎo)，發(fā)現(xiàn)胚胎期8.5-10.5天期間誘導(dǎo)時，在小鼠的心臟中可以檢測到同時標記為綠色和紅色熒光的心肌細胞，主要發(fā)生在右心室，且由頭側(cè)向心尖部位逐漸減弱，證明第二心區(qū)的祖細胞（非心肌細胞）對心肌細胞的貢獻逐漸降低。在11.5天之后，發(fā)現(xiàn)很難檢測到同時標記為綠色和紅色熒光的心肌細胞，證明再無非心肌細胞向心肌細胞進行轉(zhuǎn)化（Fig2）。

Fig2?Immunostaining?for tdTomato, ZsGreen and TNNI3 on heart sections showed?tdTomato+?ZsGreen+?TNNI3+?cardiomyocytes (arrowheads).

部分以往研究認為Tnnt2這個marker，在胚胎期11.5天之后不能準確代表心肌細胞，研究人員為了更嚴謹?shù)淖C明結(jié)論，又委托南模生物構(gòu)建了Myh6-IRES-Cre小鼠來替換Tnnt2-Cre小鼠，同樣的策略顯示在胚胎期11.5天之后確實沒有心肌細胞向心肌細胞進行轉(zhuǎn)化（Fig3）。

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Fig3 Analysis of NMC in embryos by Myh6-IRES-Cre;R26-LDLZ;R26-RSR-tdTomato.

研究人員利用該雙同源重組技術(shù)揭示了在小鼠新生期穩(wěn)態(tài)及心尖切除損傷修復(fù)過程中，也不會出現(xiàn)非心肌細胞向心肌細胞轉(zhuǎn)化（NMC）的現(xiàn)象，因此認為心肌細胞的新生主要來源于舊有心肌細胞的增殖（Fig4）。

Fig4 Cartoon image showing the frequency of NMC events from E8.0 to neonatal stages and after injury.

基于心臟發(fā)育過程中非心肌細胞向心肌細胞轉(zhuǎn)化（NMC）的研究，為心肌細胞來源與再生機制研究提供了重要的基礎(chǔ)信息。