自噬是真核細胞維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)的一種內(nèi)在平衡機制。大量證據(jù)表明自噬通路在多種疾病與生理過程中起著重要作用，如：神經(jīng)系統(tǒng)疾病、腫瘤、心血管疾病、感染、代謝性疾病、自身免疫性疾病等等，自噬通路也就成為是很多疾病潛在的靶向治療通路。大隅良典因“對細胞自噬機制的發(fā)現(xiàn)”獲得2016年度的諾貝爾生理學或醫(yī)學獎。

?

那么在自噬研究中有哪些經(jīng)典熱門靶點呢？今天我們就來說說大自噬Macroautophagy (也可以簡稱為自噬Autophagy)中的一些關(guān)鍵分子。

?

什么是自噬？

Autophagy（自噬）來自于希臘語，是auto=self和phagy=phagein=to eat的結(jié)合。細胞是怎么吃掉自己（self-eating）的呢？大致是一個通過膜將部分胞質(zhì)和細胞內(nèi)需降解的細胞器、蛋白質(zhì)等組分包裹起來形成自噬體，后與溶酶體融合形成自噬溶酶體，最終降解其所包裹的內(nèi)容物的過程。

?

自噬發(fā)生可以大概總結(jié)為以下幾個階段：

• 自噬泡(phagophore)的發(fā)生

• 自噬體(autophagosome)的形成

• 自噬的運輸融合(fusion)：自噬體與溶酶體融合形成自噬溶酶體

• 自噬的降解(degradation)

?

?

The autophagic process. (Michelle Cicchini, et al. 2015)

?

關(guān)鍵分子標志物

自噬的整個過程中, 時刻都受到不同的自噬相關(guān)基因(autophagy-related gene, ATG)的調(diào)控, 大約已有38個自噬相關(guān)基因被發(fā)現(xiàn)。這些基因在酵母和哺乳動物高度保守, 是自噬發(fā)生必不可少的分子，參與了自噬發(fā)生的不同階段。

?

Atg1(ULK1)蛋白激酶復合體

Atg1是第一個在酵母中被成功克隆的自噬基因,哺乳動物中的同源基因為ULK1 (unc-51-like kinase 1)。ULK1是自噬泡形成所必需的一種蛋白，以復合物的形式存在, 與至少三種蛋白質(zhì)組成復合物：ATG13，F(xiàn)IP200和ATG101。蛋白復合物的形成對維持ULK1的穩(wěn)定性和激酶活性十分重要。在存在氨基酸的情況下，mTORC1具有活性并通過磷酸化ULK1和ATG13來抑制自噬。而當營養(yǎng)物質(zhì)缺乏時, 溶酶體表面上的mTORC1活性被抑制, ULK1和ATG13快速去磷酸化，導致ULK1激酶的活化并誘導自噬發(fā)生。在營養(yǎng)能量缺乏時, AMPK也可以通過磷酸化ULK1激活其活性, 從而進一步促進自噬。

??

The ULK1 complex undergoes multiple modifications: phosphorylation (P), acetylation (Ac) and ubiquitylation (Ub). Modifications coloured in green suggest activation, whereas in red inhibition, of the ULK1 complex and autophagy. (Maria Zachari, et al. 2017)

?

Vps34（PIK3C3）-Beclin1（BECN1）復合物PI3K

Vps34是哺乳動物中的第III類PI3 Kinase（PIK3C3），磷酸化磷脂酰肌醇（PI）產(chǎn)生磷脂酰肌醇三磷酸（PI3P），這對于自噬泡膜的延伸和ATG蛋白向自噬泡的招募至關(guān)重要。Vps34因結(jié)合Vps15而被激活, 并進一步結(jié)合Beclin-1形成Vps34-Vps15-Beclin1復合物。

?

Beclin1（BECN1）是酵母Atg6在哺乳動物中的同源基因。由于Beclin1與腫瘤的密切關(guān)系，成為了自噬與腫瘤關(guān)聯(lián)的重要紐帶。Beclin1被ULK1磷酸化，并作為PI3K復合物的整體支架，促進自噬蛋白定位到自噬泡。當PI3K復合物與其他不同的調(diào)節(jié)蛋白結(jié)合時，選擇性地參與自噬的不同階過程，如：與Atg14結(jié)合參與自噬泡的形成；與UVRAG結(jié)合參與自噬泡的成熟和運輸?shù)取?/p>

?

?

Phosphatidylinositol 3-kinase complex and Phosphatidylinositol 3-phosphate (PI3-P) generation from phosphatidylinositol (PI).

?

Atg12-Atg5復合物

自噬泡的延伸會形成自噬體，一般為雙層膜細胞器。自噬發(fā)生過程中有兩個類泛素化修飾過程, 分別發(fā)生在Atg5-Atg12系統(tǒng)和LC3系統(tǒng)中，對于自噬泡的延伸與自噬體的成熟非常重要。

?

Atg5是參與自噬泡中吞噬細胞膜延伸的關(guān)鍵蛋白，它與Atg12形成組成型的復合物。在此過程中，首先Atg7作為類E1泛素活化酶激活A(yù)tg12；然后Atg12被傳遞給類E2泛素轉(zhuǎn)移酶Atg10；最后Atg12與Atg5結(jié)合形成復合物。之后Atg12-Atg5復合物又進一步與Atg16L結(jié)合形成Atg12-Atg5-Atg16L復合物，定位于自噬體的外膜上。Atg5-Atg12-Atg16L復合物具有類E3連接酶活性, 主要通過激活A(yù)tg3酶活性, 促進LC3（也就是Atg8）從Atg3轉(zhuǎn)移到底物磷脂酰乙醇胺(PE)上。一旦自噬體形成后，Atg5-Atg12-Atg16L復合物就從膜上解離下來。

?

LC3-PE復合物

LC3也叫微管相關(guān)蛋白1輕鏈3 (microtubule- associated protein1 light chain 3，MAP1LC3)，是Atg8在哺乳動物中的同源物。包括兩種可相互轉(zhuǎn)化的形式即LC3-I和LC3-II，參與了自噬體膜的形成。Atg4切割早期合成的pro-LC3暴露C端甘氨酸形成胞漿可溶形式的LC3-I。誘導自噬后，LC3-I在類E1酶Atg7、類E2酶Atg3以及類E3酶Atg5-Atg12-Atg16L復合物的共同作用下與自噬體膜表面的底物PE偶聯(lián)，形成膜結(jié)合形式的LC3-II。LC3-II是自噬體的重要標志分子, 隨自噬體膜的增多而增加。

?

Atg5-Atg12 complex conjugation system and?LC3-PE conjugation system. ?(Jong-Ok Pyo, et al. 2012)

?

基于LC3的自噬流檢測方法

超微電鏡是觀察自噬現(xiàn)象的最直接的方法。不過，超微電鏡只能提供靜態(tài)信息，不能檢測自噬流，也不能區(qū)分自噬體的積累是由于自噬的誘導還是下游自噬過程的阻塞。而Atg蛋白的免疫印跡分析或免疫熒光染色也存在著無法檢測自噬流或不能判斷自噬改變的原因的局限性。

目前用于觀察自噬流變化的主流方法是LC3雙熒光標記法，即細胞中同時帶有RFP和GFP兩種不同顏色的熒光蛋白與LC3蛋白融合，從而可以實時監(jiān)測自噬體到自噬溶酶體的變化過程，監(jiān)控自噬流。

其原理是：自噬體內(nèi)腔pH值約為7，而溶酶體pH值約為4。自噬體與溶酶體融合后，腔室內(nèi)pH降為4。利用GFP在酸性環(huán)境中淬滅、RFP則可以穩(wěn)定發(fā)光的特點，來觀察細胞自噬體的成熟或自噬流的變化。

當自噬發(fā)生時，自噬體被RFP與GFP同時標記，可見明亮黃色光斑（RFP+GFP+）。當自噬體成熟、自噬體和溶酶體融合時，自噬溶酶體內(nèi)的pH值降低，使GFP熒光淬滅，因此只可觀測到紅色RFP+光斑，指示自噬溶酶體。如果自噬體與溶酶體可正常融合，那么紅色RFP+光斑數(shù)量大于黃色RFP+GFP+光斑；如果自噬降解受阻，自噬體與溶酶體不能正常融合，那么僅黃色RFP+GFP+光斑增加，主要為黃色熒光。LC3雙熒光基因敲入小鼠可以用在體內(nèi)實時監(jiān)測自噬過程。

?

Mice express RFP-EGFP-LC3 or mCherry-EGFP-LC3 for measuring autophagy flux. The numbers of GFPC RFPC puncta (yellow) and RFP puncta (red) are counted. Yellow puncta represent phagophores and autophagosomes, and red puncta represent autolysosomes.（Akiko Kuma, et al. 2017）

?

利用自噬缺陷小鼠模型研究自噬

對Atg基因敲除小鼠的分析有助于理解體內(nèi)自噬的生理作用。關(guān)鍵Atg基因全身性敲除純合子小鼠往往是胚胎或新生致死的，例如：Becn1-/-小鼠在E8.5天死亡，Atg5-/-和Atg7-/-小鼠大約在出生后1天死亡。

可以利用條件性Atg基因敲除小鼠，在特定組織或特定時期阻斷自噬的形成。例如：Becn1f/f; Pcp2-Cre在Purkinje細胞中敲除Becn1基因，用于研究神經(jīng)退行性病變。Atg7f/f;UBC-CreERT2在他莫昔芬給藥后誘導廣泛性Atg7基因缺失，避免純合子小鼠新生致死，可用于研究成年小鼠自噬缺失后的病理與生理變化，如：神經(jīng)退行性病變或免疫異常等等。

或者可以將Atg基因敲除小鼠與組織特異性啟動子驅(qū)動Atg基因表達的轉(zhuǎn)基因小鼠交配，在特定組織中恢復Atg基因的表達，例如：Atg5-/-;Eno2-Atg5在神經(jīng)元中表達外源Atg5基因，可以挽救Atg5缺失小鼠的神經(jīng)元損傷和新生致死，使大多數(shù)小鼠存活8周至8個月。

?

南模生物可提供的小鼠品系

Becn1-KO

Becn1-CKO

Atg5-KO

R26-(CAG-LSL-mCherry-EGFP-LC3-pA)

?

參考文獻

Cicchini M, Karantza V, Xia B. Molecular pathways: autophagy in cancer--a matter of timing and context. Clin Cancer Res. 2015 Feb 1;21(3):498-504.

Zachari M, Ganley IG. The mammalian ULK1 complex and autophagy initiation. Essays Biochem. 2017 Dec 12;61(6):585-596.

Pyo JO, Nah J, Jung YK. Molecules and their functions in autophagy. Exp Mol Med. 2012 Feb 29;44(2):73-80.

Kuma A, Komatsu M, Mizushima N. Autophagy-monitoring and autophagy-deficient mice. Autophagy. 2017 Oct 3;13(10):1619-1628.

Li L, Wang ZV, Hill JA, et?al. New autophagy reporter mice reveal dynamics of proximal tubular autophagy. J Am Soc Nephrol. 2014 Feb;25(2):305-15.

Glick D, Barth S, Macleod KF. Autophagy: cellular and molecular mechanisms. J Pathol. 2010 May;221(1):3-12.