CRISPR-Cas技術(shù)可以說是目前生命科學領(lǐng)域發(fā)展最為迅速、最耀眼、最有前景的技術(shù)了。它究竟是怎么回事？是怎么一步一步發(fā)展起來的？為什么這么火？到底怎么用呢？

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CRISPR-Cas作為細菌的適應性免疫系統(tǒng)，當外源病毒或質(zhì)粒DNA進入細胞時，專門的Cas蛋白將外源DNA剪成小片段，并將它們粘貼到連續(xù)的DNA片段中，稱為CRISPR序列。然后，Cas蛋白表達并加工CRISPR基因座以產(chǎn)生CRISPR RNA（crRNA）。通過序列同源性，這些crRNA基于序列特異性將Cas復合物靶向到外源DNA，并切割目標DNA以干擾外來入侵者。

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圖.?An overview of CRISPR/Cas as a bacterial adaptive immune system. （圖片來自Wikipedia, accessed 25 November 2013. Author: James Atmos）

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CRISPR簡史

1987年，Nakata研究組在分析大腸桿菌iap基因及周邊序列時發(fā)現(xiàn)iap?基因3’端存在含有29個核苷酸高度同源重復序列，它們被含32個核苷酸的序列間隔開。但當時人們并不知道這些重復序列究竟有什么作用。之后的幾年中，在其它多種微生物中也陸續(xù)發(fā)現(xiàn)這類重復性序列。

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而“CRISPR”正式得名是在2002年，由Mojica和Jansen實驗室首次提出。CRISPR是Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats的縮寫，代表了同一類特征明顯、排列整齊、秩序一致的重復序列。多個CRISPR相關(guān)基因則被命名為Cas（CRISPR-associated）家族。

2005年，兩個研究小組（Mojica和Pourcel）都觀察到CRISPR中的許多間隔序列來源于質(zhì)粒和病毒起源，Mojica提出CRISPR是一種適應性免疫系統(tǒng)的假設。同年，Bolotin研究組在嗜熱鏈球菌中發(fā)現(xiàn)了Cas9，并預測這個龐大的蛋白質(zhì)具有核酸酶活性。并且他們發(fā)現(xiàn)與病毒同源的間隔序列都具有一種類似的尾巴，稱為PAM（protospacer adjacent motif）序列，對靶序列的識別至關(guān)重要。

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嗜熱鏈球菌廣泛用于乳制品行業(yè)制作酸奶和奶酪，Danisco公司的Horvath與其同事試圖解決嗜熱鏈球菌免受噬菌體攻擊這一問題。2007年，他們通過實驗證明CRISPR系統(tǒng)確實是一種適應性免疫系統(tǒng)：嗜熱鏈球菌被病毒入侵后整合了來自噬菌體基因組新的間隔區(qū)序列，同樣的病毒再次入侵時細菌就有了抗性，使其免遭攻擊。如果改變特定間隔區(qū)序列，則會影響細菌抵抗噬菌體的免疫功能。他們還研究了Cas7和Cas9，認為Cas9蛋白可能是產(chǎn)生這種免疫能力所必需的。

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隨后，科學家們紛紛開始補充CRISPR-Cas系統(tǒng)干擾噬菌體機制的細節(jié)。

2008年，John van der Oost研究小組先在大腸桿菌中發(fā)現(xiàn)，來自噬菌體的間隔序列被轉(zhuǎn)錄成小RNA，成為CRISPR RNA（crRNA），引導Cas蛋白到靶DNA上。Marraffini和Sontheimer在同年證明了CRISPR-Cas系統(tǒng)的目標分子是DNA，而不是RNA。他們還明確指出，如果將該系統(tǒng)轉(zhuǎn)移到非細菌系統(tǒng)中，可能成為一種強大的工具系統(tǒng)。

2010年12月，Moineau團隊證明了CRISRP-Cas9在PAM序列上游位置精確切割，使DNA雙鏈斷裂。而作為II型CRISPR系統(tǒng)的顯著特征，Cas9是切割唯一需要的蛋白，它與crRNAs共同介導CRISPR-Cas9的干擾功能。

2011年，Charpentier研究組對釀膿鏈球菌進行了小RNA測序，發(fā)現(xiàn)除了crRNA以外，還存在一種小RNA，稱為式激活CRISPR RNA（tracrRNA）。tracrRNA通過24個核苷酸與crRNA中的重復序列互補配對與形成雙鏈，引導Cas9到其目標DNA。至此，天然CRISPR-Cas9干擾機制的拼圖基本拼搭完整。

2011年7月，Siksnys團隊克隆了來自嗜熱鏈球菌（II型系統(tǒng)）的整個CRISPR-Cas基因座，使其在不含II型系統(tǒng)的大腸桿菌中表達，實現(xiàn)了對質(zhì)粒和噬菌體DNA的靶向干擾。證明了Cas9是干擾唯一必需的蛋白，而它的Ruvc和HNH核酸酶結(jié)構(gòu)域都是必不可少的。

2012年6月和9月，Charpentier、Doudna團隊與Siksnys團隊，先后發(fā)表了CRISPR-Cas系統(tǒng)應用于基因編輯的論文。

他們在體外系統(tǒng)中證明了crRNA通過堿基互補配對與tracrRNA形成雙鏈RNA，指導Cas9蛋白在目標DNA上切割，引起雙鏈斷裂。精確的平端切割位點位于PAM上游3個核苷酸位置，而Cas9蛋白的HNH核酸酶結(jié)構(gòu)域切割crRNA的互補鏈， RuvC樣結(jié)構(gòu)域切割非互補鏈。tracrRNA:crRNA在被融合為單鏈向?qū)NA（single guide RNA，sgRNA）時也可以發(fā)揮指導Cas9的作用。此外，crRNA可以減少到20nt，仍足以有效切割；通過改變crRNA的序列可以重新定位Cas9的靶向位點。

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圖.?左起：Emmanuelle Charpentier、Virginijus ?ik?nys、Jennifer Doudna （圖片來自http://kavliprize.org）

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These findings pave the way for engineering of universal programmable RNA-guided DNA endonucleases.

——Siksnys

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A successful example of the application of our basic research in biotechnology and medicine is our recent discovery of an RNA-guided DNA cleavage mechanism that has been harnessed as an RNA programmable genome engineering technology and that stems from our analysis of the adaptive immune CRISPR-Cas9 system in bacterial pathogens.

——Emmanuelle Charpentier

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很快，2013年初的3篇論文都將CRISPR-Cas系統(tǒng)成功地應用到了哺乳動物細胞中。

其中，Church研究組設計了II型CRISPR-Cas系統(tǒng)，在人293T細胞、K562細胞以及誘導多能干細胞中通過設計sgRNA成功靶向特定序列，且多個gRNA可以實現(xiàn)對目標基因的多重編輯。

張鋒實驗室證明了CRISPR-Cas9系統(tǒng)可以在人類和小鼠細胞中進行精確的定點切割，并且將Cas9突變?yōu)槿笨诿?，促進同源修復過程。

Qi研究組則建立了CRISPRi系統(tǒng)，將Cas9改造為失去核酸內(nèi)切酶活性的dCas9，通過sgRNA的指導定點結(jié)合到目標基因座上，從而抑制目標基因的表達。同年，還實現(xiàn)了多sgRNAs 靶向多基因(Tet1、Tet2、Tet3、Sry 和Uty)的同時定點突變。

Wu等人利用CRISPR-Cas9系統(tǒng)對Crygc 顯性突變的小鼠進行基因治療使其獲得了健康的后代，為CRISPR-Cas9 系統(tǒng)用于遺傳疾病的基因治療提供了依據(jù)。

之后，Mizuno等人利用CRISPR-Cas9技術(shù)成功構(gòu)建了酪氨酸酶基因(Tyr)突變的白化病小鼠模型。Thomas 等人利用CRISPR-Cas9 系統(tǒng)在斑馬魚中成功實現(xiàn)了Gal4 基因的定點編輯。

由此，CRISPR系統(tǒng)在多種生物的基因定點編輯、基因組篩選、基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控、基因組成像、基因診療、生態(tài)應用等領(lǐng)域的研究與應用開始井噴。

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圖.?Timeline of CRISPR-Cas and genome engineering research fields. （圖片來自Ref.4）

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2015年，張鋒實驗室又發(fā)現(xiàn)了一類新的CRISPR-Cas系統(tǒng)：CRISPR-Cpf1。Cpf1蛋白是一種比spCas9蛋白更小更簡單的核酸內(nèi)切酶，自然形態(tài)下僅需要一條RNA引導。Cpf1蛋白切割DNA后產(chǎn)生黏性末端，便于新DNA序列插入。Cpf1識別富含胸腺嘧啶（T）的PAM序列，這也擴展了基因編輯靶點的選擇范圍。越來越多的研究發(fā)現(xiàn)CRISPR-Cpf1系統(tǒng)在特異性和多基因編輯方面都有著很大的優(yōu)勢。

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2016年，張鋒實驗室發(fā)現(xiàn)一種來自纖毛菌（Leptotrichia shahii）的CRISPR酶Cas13a（C2c2）蛋白具有RNA介導的RNA酶功能。8個月后，他們又發(fā)現(xiàn)了另一種同類酶Cas13b。

2017年，連續(xù)多篇文章研究了CRISPR-Cas13系統(tǒng)的作用機制、在臨床診斷中的應用以及在哺乳動物細胞靶向RNA的能力。

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不僅CRISPR技術(shù)迅速發(fā)展，它在轉(zhuǎn)化醫(yī)學和疾病治療領(lǐng)域中的應用也不斷創(chuàng)造出驚喜。

2015年12月31日Science雜志發(fā)表了三個獨立研究小成功使用CRISPR治療遺傳性疾病動物模型的方法。他們利用CRISPR系統(tǒng)編輯Dystrophin基因，能夠不同程度修復杜氏肌營養(yǎng)不良癥小鼠的肌肉功能，從而達到治療DMD的效果。2018年，又利用CRISPR技術(shù)成功治療了四只患有DMD（Duchenne型肌營養(yǎng)不良癥）的狗，并將其肌肉和心臟組織中的營養(yǎng)不良蛋白恢復到正常水平的92%。

此外，CRISPR技術(shù)還與細胞免疫療法相結(jié)合以完善CAR-T療法，并在小鼠中增強了腫瘤抑制作用。首次利用CRISPR-Cas9在T細胞中敲除PD-1基因的臨床試驗已被批準用于治療肌肉浸潤性膀胱癌、去勢抵抗性前列腺癌、轉(zhuǎn)移性腎癌和轉(zhuǎn)移性非小細胞肺癌，這些I期臨床試驗已于2016年開始。

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CRISPR系統(tǒng)的分類

CRISPR-Cas系統(tǒng)包含CRISPR基因座和Cas基因兩部分。

其中，CRISPR基因座主要由前導序列（leader）、重復序列（repeat）和間隔序列（spacer）構(gòu)成。前導序列富含AT堿基，且位于CRISPR基因座上游；重復序列的長度約20–50 bp堿基且包含5–7 bp回文序列，轉(zhuǎn)錄出的莖環(huán)結(jié)構(gòu)能夠穩(wěn)定RNA的整體二級結(jié)構(gòu)；間隔序列為從外源捕獲的核酸片段。

Cas基因位于基因座附近或分散于基因組其他地方，編碼Cas蛋白在防御過程中至關(guān)重要。

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依據(jù)Cas蛋白在細菌免疫防御過程中參與的角色，目前將CRISPR-Cas系統(tǒng)分為兩大類。

第一大類：它們切割外源核酸的效應因子為多個Cas蛋白形成的復合物，包括Ⅰ型、Ⅲ型和Ⅳ型。第二大類：它們的作用因子是比較單一的Cas蛋白，比如Ⅱ型的Cas9蛋白和Ⅴ型的Cpf蛋白。

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目前，被最為廣泛應用的CRISPR系統(tǒng)是II型CRISPR-Cas系統(tǒng)，也就是CRISPR-Cas9系統(tǒng)。

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圖.?Schematic diagram of classification, typical architecture, functional components in CRISPR-Cas system. （圖片來自Ref.11）

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II型CRISPR系統(tǒng)的基本原理與優(yōu)化

II型CRISPR-Cas系統(tǒng)是最為簡單的一種CRISPR系統(tǒng)，也是CRISPR介導的基因組編輯技術(shù)的基礎。

目前應用最廣泛的化膿性鏈球菌（SP）的CRISPR-Cas9系統(tǒng)包括：CRISPR序列，四種蛋白質(zhì)編碼基因（Cas9、Cas1、Cas2和Cns2）和tracrRNA。

spCas9基因編碼核酸酶，是切割外源入侵DNA的主要蛋白，而Cas1、Cas2和Cns2蛋白在獲取CRISPR間隔序列的過程中起作用（下圖A）。該系統(tǒng)工作時，CRISPR序列和tracrRNA被轉(zhuǎn)錄，產(chǎn)生長的pre-crRNA和tracrRNA（下圖B）。 這兩種RNA通過互補序列形成雙鏈，并由Cas9和RNase III加工成較短的形式（下圖C）。 隨后，Cas9-tracrRNA-crRNA復合物開始搜索與間隔序列匹配的DNA序列（下圖D，紅色表示目標DNA序列）。與目標DNA靶點的結(jié)合還需要存在PAM位點。一旦Cas9被crRNA指引到目標DNA位點上發(fā)生結(jié)合，它就切割PAM位點上游3nt位置的DNA。

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圖.??Class 2, Type II CRISPR-Cas9 System from Streptococcus thermophilus （圖片來自Ref.3）

根據(jù)上述機制，一個簡化的Ⅱ型CRISPR-Cas靶向系統(tǒng)必定要含有：Cas作用蛋白（如最為常用的spCas9）和單鏈向?qū)gRNA。sgRNA的結(jié)構(gòu)包括：5‘端的一段短（~20nt）的指導序列（guideRNA，gRNA），與目標DNA序列互補匹配，并決定了Cas9蛋白定向切割的特異性；3’端有用于結(jié)合Cas9蛋白的骨架結(jié)構(gòu)（Scaffold）。

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圖 The CRISPR-Cas9 System for Genome Editing （圖片來自Ref.12）

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隨著對II型CRISPR-Cas系統(tǒng)的不斷探索，?CRISPR-Cas9系統(tǒng)也在不斷被優(yōu)化，旨在降低由于sgRNA與非靶向序列局部匹配或存在非標準PAM（NAG而非NGG）而激活Cas9產(chǎn)生的脫靶效應，并提高整套系統(tǒng)的精確性和實用性。

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優(yōu)化1：改造Cas9蛋白

（1）降低Cas9蛋白的核酸內(nèi)切酶活性。比如：分別突變Cas9的D10A和?H840A 使其成為切口酶，只能對單鏈進行切割，因而需要2條sgRNA同時引導才能引起雙鏈DNA斷裂，從而降低脫靶的概率。

（2）降低Cas9蛋白的DNA結(jié)合能力。對Cas9蛋白進行定點突變形成eSpCas9（K848A / K1003A / R1060A）、SpCas9-HF1（N497A / R661A / Q695A / Q926A）和HypaCas9（N692A / M694A / Q695A / H698A）。通過削弱Cas9蛋白與DNA的非特異性結(jié)合的能力，增強靶向序列與Cas9蛋白結(jié)合的競爭力。

（3）降低對非標準PAM（NAG）的識別能力。Cas9突變體D1135E對標準PAM（NGG）的識別更加特異。

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優(yōu)化2：優(yōu)化sgRNA

（1）采用較短的sgRNA指導序列的長度，20個核苷酸序列可以減低脫靶效應而不影響編輯效果。

（2）增加sgRNA的穩(wěn)定性。如在gRNA中增加一對A-U堿基配對等方法。

（3） 充分利用sgRNA 設計和 off-Target評估網(wǎng)站，如：CRISPR design tool (http://crispr.mit. edu)、 ZiFiT (http://zifit.partners.org/ZiFiT/)、 Cas9 design (http://cas9.cbi.pku.edu.cn/)、E-CRISPR (http:// www.e-crisp.org/)、 Cas-offinder (http://www. rgenome.net/cas-offinder/)、 CHOPCHOP (https:// chopchop.rc.fas.harvard.edu/index.php)等等。

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如何利用CRISPR系統(tǒng)編輯小鼠基因？

簡單地來說，使用CRISPR系統(tǒng)獲得基因工程小鼠的過程大致是：

第一步

首先，根據(jù)目標基因靶序列設計出 sgRNA。目標基因靶序列可以是任何約為20個核苷酸的DNA序列，只要它符合兩個條件：

• 靶序列在細胞基因組中具有獨特性。

• 靶序列緊鄰PAM位點。

第二步

通過顯微注射的方式，使小鼠受精卵中共表達內(nèi)切核酸酶（如spCas9）和sgRNA。表達出來的Cas9蛋白通過與sgRNA骨架結(jié)合形成核糖核蛋白復合體，Cas9蛋白構(gòu)象發(fā)生改變，成為具有DNA結(jié)合活性的構(gòu)象。

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通過sgRNA指導序列與目標基因靶序列的特異性匹配，Cas9蛋白結(jié)合到指定基因的靶DNA上，此時發(fā)生第二次構(gòu)象變化，其RuvC和HNH核酸酶結(jié)構(gòu)域在PAM序列上游約3-4個核苷酸的位置分別切割DNA的兩條互補鏈，最終造成目標基因靶DNA的雙鏈斷裂（DSB）。

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然后，通過以下兩種常規(guī)修復途徑之一修復DNA雙鏈斷裂：

• 非同源末端連接（NHEJ）修復：有效但容易出錯

NHEJ修復途徑是最活躍的修復機制，通常在DSB位點引起核苷酸插入或缺失。NHEJ介導的DSB隨機修復就會導致靶DNA中產(chǎn)生小片段插入或缺失，造成移碼突變使靶基因的開放閱讀框（ORF）過早出現(xiàn)終止密碼子。這也就是利用CRISPR-Cas系統(tǒng)建立基因敲除模型的原理。

• 同源定向修復（HDR）：效率較低但高保真

同源定向修復（HDR）可以將特定的外源突變引入到目標基因DNA中，從單堿基突變到大片段插入都可以，這就為點突變、基因敲入小鼠模型的建立提供了有力工具，比如在目的基因中添加熒光基團或標簽、共表達其它基因等。

采用HDR途徑進行基因編輯，需要將含有外源序列的DNA修復模板與gRNA和Cas9一起注射到小鼠受精卵中。外源修復模板必須包含所需的外源序列以及緊鄰靶標上游和下游的同源序列（稱為左右同源臂也稱為5’或3’同源臂）。每個同源臂的長度取決于插入片段的大小，一般來說插入片段越大所需要的同源臂長度也越大。

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圖.??DNA repair after double-strand break. （圖片來自Wikipedia, accessed 25 September 2017. Author: Mariuswalter）

第三步

在小鼠受精卵接受顯微注射后大約19天，就可以獲得首建鼠（F0）了。特別需要注意的是，無論是NHEJ途徑還是HDR途徑，獲得的首建鼠都是可能攜帶多種等位基因的嵌合體小鼠。因為Cas9 mRNA翻譯為蛋白質(zhì)需要一定的時間，而受精卵基因組第一次復制前的窗口期非常短暫，一旦錯過單細胞受精卵時期，Cas9蛋白和sgRNA對新生成的細胞仍進行不同的編輯，就會出現(xiàn)帶有不同編輯類型的細胞的嵌合體。

第四步

所以，接下來需要將獲得的首建鼠與野生型小鼠交配，獲得特定等位基因生殖系遺傳的F1代小鼠。

第五步

進行實驗組與對照組小鼠繁育。

圖 Flow scheme of CRISPR-Cas9 mediated mouse model generation.（圖片來自Ref.12）

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CRISPR系統(tǒng)的優(yōu)勢？?

與傳統(tǒng)的利用小鼠ES細胞獲得基因工程小鼠模型的方法相比，CRISPR-Cas9技術(shù)跳過了小鼠ES細胞的操作與篩選，直接對小鼠受精卵進行操作。這樣一來，

• 打破了基因修飾小鼠品系的選擇受到小鼠ES細胞品系的限制

• 更重要的是，將獲得F0代小鼠的周期從8-10個月縮短至2-3個月

• 同時也大大降低了成本

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與其它核酸酶系統(tǒng)（如ZFNs 和TALENs）相比，CRISPR系統(tǒng)也具有一些獨特的優(yōu)勢：

• CRISP

• R-Cas系統(tǒng)的靶點在基因組中分布頻率高，以spCas9為例，在基因組中幾乎每8 bp 就有一個靶點；

• 可以同時對多個靶點進行基因操作；

• 系統(tǒng)簡單，制備方便，節(jié)約大量的時間和經(jīng)濟成本。

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圖.?傳統(tǒng)小鼠ES細胞打靶途徑Vs?CRISPR基因編輯途徑制備基因工程小鼠周期對比。（圖片來自Addgene）

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